Transcript EaL_L13_重組DNA與遺傳工程

The Flow of Genetic Information
The Central Dogma – 分子生物學的中心教條:
RNA Replication
DNA Replication
Transcription
DNA
RNA
Reverse Transcription
DNA  DNA
DNA  RNA
RNA  DNA
Transcriptase)
RNA  RNA
Translation
Protein
DNA-dependent DNA Polymerase (DNA Replicase)
DNA-dependent RNA Polymerase (Transcriptase)
RNA-dependent DNA Polymerase (Reverse
RNA-dependent RNA Polymerase (RNA Replicase)
DNA 合成酶、轉錄酶、反轉錄酶、RNA合成酶
遺傳工程（重組DNA)
重組DNA技術的條件：
基本工具：enzymes
基因的來源: purified DNA or cDNA
(complementary DNA)
3. 傳輸工具：transformation, infection,
electroporation, microinjection, gene gun
4. 篩選技術: specific antibody screening, hybridization
(radioactive isotope or fluorescent agent label),
5. 基因表現：expression vectors, protein purification
1.
2.
The toolkit for DNA technology:
1. Restriction enzymes限制脢: Daniel
Nathans, Hamilton Smith and Werner Arber
(1978 Nobel Prize)
2. DNA vector載體
3. Host organisms宿主
Restriction enzymes限制脢:
1.Daniel Nathans, Hamilton Smith and
Werner Arber (1978 Nobel Prize), DNA
ligase 黏合脢
互補DNA的製造
製備cDNA
分
離
特
定
基
因
的
方
法
DNA vector載體：
1. cloning vector 選殖載體（Bacterial
plasmids細菌質體、Bacteriophages噬菌
體）
2. Shuttle vectors穿梭載體（應用在酵母菌
yeast和細菌之上）
3. Retroviruses反轉錄病毒（藉由感染的方
式）
大腸桿菌的質體
質體的放大圖
細
菌
間
質
體
基
因
的
轉
移
Host organisms宿主:
(1)
Bacteria: 優點：繁殖快速、容易操
作，缺點：轉錄和轉譯調控機制與真核
細胞不同
(2)
Yeast: 優點：真核細胞的調控，缺點
：不易操作
(3)
Animal or plant cell: 優點：高等生物
細胞的表現，缺點：不易接納外來DNA
重組DNA的方法
遺傳工程的應用
一、 Diagnosis of Genetic Diseases遺傳疾
病的診斷
二、 Human Gene Therapy 人類基因療法
三、 Vaccines疫苗
四、 Pharmaceutical products藥品製造
五、 Forensic 法醫
六、 Environment 環保
七、 Agricultural 農業
GMO：基因重組生物
轉殖生長基因的老鼠
Agricultural 農業
Transgenic animals
n enlarge valuable parts
n resistant to pathagens
n improved agricultural products, such as
change AAs compositions
Transgenic plants
Ti plasmid (Tumor-inducing plasmid)
Agrobacterium tumefaciens根瘤土壤桿菌
Antisense genes反義基因抑制番茄成熟
利用細菌轉殖植物細胞的方法
轉殖致瘤基因的植物
抗除草劑基因的棉花
螢光煙草：轉殖作物
Human Gene Therapy
人類基因療法
SCID (severe combined immunodeficiency)
重度混合免疫不全症
1. retroviral vector + ADA(腺甘脫胺脢)
T lymphocyte   intravenous injection
2. ADA gene bone marrow cell
Diagnosis of Genetic Diseases
遺傳疾病的診斷
Cystic fibrosis 囊性纖維變性
Huntington's disease 亨氏舞蹈症
聚合脢連鎖反應
-1
聚合脢連鎖反應
-2
Enzyme
• Polymerase bind single stranded DNA at a
point adjacent to a double-stranded stretch,
and binds to dNTPs (deoxynucleotide
triphosphates)
Components of PCR reaction:
Enzyme (Taq, Vent, Pfu)
Appropriate buffers
Ample dNTPs
Template DNA
Primers
Cofactors (eg. Magnesium)
The cycle 1
• Denaturation
•
94 or 92℃, 30 sec/incubation
•
Half activity after 30 incubations at
94℃ for 60 sec each.
•
60-120 sec for the first step
The cycle 2
Annealing
•
Tm = 4 (GC bases) + 2 (AT bases)
•
30-60 sec/incubation
The cycle 3
• Extension
•
72℃, 500bp/30 sec; 500-1500/60 sec
Cycles
Example:
Denature
94
94
94
Annealing
45
55
55
Extension cycles
72
5
72
30-35
72 (10 min) 1
Condition of temperature
DNA 自動定序儀
DNA 自動定序儀
autosequencer
脂蛋白與膽固醇
HDLs: 高密度脂蛋白
將膽固醇運送到肝臟加以代謝
LDLs: 低密度脂蛋白
將膽固醇運送到利用或儲存細胞
膽固醇所引起的冠狀動脈阻塞
Vaccines疫苗
Protein coat of virus or bacteria.
Modify pathogen's genome
Pharmaceutical products
藥品製造
Insulin胰島素
Growth hormones生長激素
EPO (erythropoietin) 紅血球生長素
Interferon （干擾素）
Forensic 法醫
RFLP
DNA fingerprinting
DNA電泳
DNA指紋辨識
Environment 環保
Detoxification
mining
請舉例說明運用在生物科技中
的物理、化學基本技術和原理
參考習題：
1.
2.
3.
4.
5.
怎樣從細胞中分離出我們想要研究的基因片段？
怎樣鑑定所分離的基因是我們想要找的正確目標？
如何在試管中複製DNA？
怎樣證明王小姐未來所生的小孩是鄭先生的？
請提一個可能解決現代環境問題的遺傳工程技術。