Fundamentos de

Espectrometría de Masa Biológica

3 de mayo de 2013

Matías Möller

Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 1

Bibliografía recomendada:

Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.

Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

2

Espectrometría de masa

1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

3

Espectrometría de masa

1- Generalidades

4

Espectrometría de masa

Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

5

Espectrometría de masa

Espectrometría ≠ Espectroscopía

(Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante) 6

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Biomoléculas

Determinación de masa y/o composición:   Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos  Lípidos  Lipidoma  Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar m g-ng (y menos) de material 7

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Proteínas

 Determinación de masa y/o composición   Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales   Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento  Niveles de expresión/modificación posttraduccional 8

Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/ 9

cyt C ~ 12000 Da Espectrometría de masa 10

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa biológica

Lisozima 11

Espectrometría de masa

Los Iones son importantes

En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z:

[M+H]

+

o

[M-H]

-

De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H] 2+ , [M+nH] n+ )

[M+Na]

+ ,

[M+K]

+ ,

[M+NH

4

]

+ ,

[M+Cl]

De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M] *+ , [M] * (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común) 12

Espectrometría de masa

PM

(péptido)

= 1162 Da

Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1 13

Espectrometría de masa

Espectrómetro de masa

Muestra

Entrada: Volatilización/ Ionización MALDI ESI Analizador de masas TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético Detector Alto Vacío 14

Espectrometría de masa

¿Cómo volatilizar una proteína?

Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes) 15

Espectrometría de masa

Espectrómetros de masa

(configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: FT-MS: ElectroSpray Ionization-Ion Trap Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance 16

Espectrometría de masa

2- MALDI-TOF

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Espectrometría de masa

Ionización por MALDI:

(Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador.

El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H + .

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico 18

MALDI-TOF

Espectrometría de masa Matriz 19

MALDI

Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz Espectrometría de masa 20

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t).

t



(m/z)

1/2

las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa) 21

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico

E

, que le imparte una energía cinética:

E

k

=

z

eEs

donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma E k , ½mv 2 = zeEs  v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D 

m/z = 2eEs(t/D)

2

22

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

E

+ -

Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + s Fuente D ½mv 2 = zeEs  v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D  m/z = 2eEs(t/D) 2 Detector 23

4-25 kV Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector

Carlos Cerveñansky

24

4-25 kV Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector

Carlos Cerveñansky

25

MALDI-TOF

Espectrometría de masa 26

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF 27

MALDI-TOF

Espectrometría de masa 28

Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1= > BC= > RSM10000= > MC= > MC= > MC[BP = 1672.8, 3222] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1655.0

1662.2

1669.4

1676.6

Mass (m/z ) Voyager Spec #1= > BC= > NR(2.00)= > MC= > MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918

100 90 40 30 20 10 80 70 60 50 0 1655.0

Carlos Cerveñansky

1662.2

1669.4

Mass (m/z ) 1676.6

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1683.8

0 1691.0

3222.3

1.6E+ 4

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

1683.8

0 1691.0

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Espectrometría de masa

Los Isótopos son importantes

Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), se basa en una escala relativa al 12 6 C = 12 amu  1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10 -24 g Abundancia isotópica: 12 C 13 C 12.0000

13.0034

98.90 % 1.10 % 30

Elemento 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 15 N 16 O 17 O 18 O 31 P 32 S 33 S 34 S 36 S 79 Br 81 Br

Carlos Cerveñansky

Masa

1.0078

2.0141

12.0000

13.0034

14.0031

15.0001

15.9949

16.9991

17.9992

30.9738

31.9721

32.9715

33.9679

35.9671

78.9183

80.9163

%

99.985

0.015

98.90

1.10

99.634

0.366

99.762

0.038

0.200

100.00

95.02

0.75

4.21

0.02

50.69

49.31

31

Carlos Cerveñansky

32

Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5725 C 12 C 13 2xC 13 2093 5729 5733 Mass (m/z) 5737 5741 5745 0 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.

(aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 m l de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)

Carlos Cerveñansky

33

MALDI-TOF

Espectrometría de masa 34

Espectrometría de masa

3- ESI-MS

35

Espectrometría de masa

ESI-Q

ElectroSpray Ionization - Quadrupole Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N 2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo 36

ESI

N 2 Espectrometría de masa 37

ESI

Espectrometría de masa 38

Espectrometría de masa

ESI-Q

Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.

Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000 39

ESI-Q

Espectrometría de masa 40

ESI-Q

Espectrometría de masa 41

ESI-Q

Espectrometría de masa 42

ESI-MS

14+ 13+ 12+ Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 43

ESI-MS

14+ 13+ 12+ Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 44

ESI-MS

Espectrometría de masa Deconvolución del espectro

(n+1) + n +

x 1 x 2  = (M+n)/n = (M+n+1)/(n+1) n = (x 2 -1)/(x 1 -x 2 ) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328 45

ESI-MS

Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo 46

ESI-MS

Bajo PM Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Alto PM 47

ESI-MS

Espectrometría de masa 48

Espectrometría de masa

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF

Cyt C 49

Cargas/ion Rango de m/z Rango de masas Interacciones no covalentes MS/MS Acoplar LC Espectrometría de masa

Comparación

MALDI-TOF

Pocas, en general 1 50000 200.000

No

ESI-(Q3 o IT)

Muchas 3000 70.000

Si limitado, PSD No Si, CID Si Tolerancia a contaminantes Si No 50

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