Fundamentos de

Espectrometría de Masa Biológica

8 de mayo de 2014

Matías Möller

Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 1

Bibliografía recomendada:

Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.

Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3 2

Espectrometría de masa

1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

3

Espectrometría de masa

1- Generalidades

4

Espectrometría de masa

Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

5

Espectrometría de masa

Espectrometría ≠ Espectroscopía

(Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante) 6

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Biomoléculas

Determinación de masa y/o composición:   Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos  Lípidos  Lipidoma  Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar m g-ng (y menos) de material 7

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Proteínas

 Determinación de masa y/o composición   Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales   Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento  Niveles de expresión/modificación posttraduccional 8

Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/ 9

Masa (definiciones)

• Se determina

m/z

•

q

= ±

ze

, e

= 1.6022 x 10 -19 coulomb

•

z

siempre es un integral positivo 10

Masa

• Todas las moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) C 6 12.011

6 12 C 6 13 C 6 14 C 11

Elemento 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 15 N 16 O 17 O 18 O 31 P 32 S 33 S 34 S 36 S 79 Br 81 Br

Carlos Cerveñansky

Masa

1.0078

2.0141

12.0000

13.0034

14.0031

15.0001

15.9949

16.9991

17.9992

30.9738

31.9721

32.9715

33.9679

35.9671

78.9183

80.9163

%

99.985

0.015

98.90

1.10

99.634

0.366

99.762

0.038

0.200

100.00

95.02

0.75

4.21

0.02

50.69

49.31

12

Masa

• La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% • Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes 13

Masa

• Ejemplo: 12 C (98.9%) y 13 C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60) La probabilidad que todos los átomos sean 12 C: P = (0.989) 60 = 0.515

14

Masa

15

Masa

16

Masa: definiciones

• Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) • u = m( 12 C) /12 = 1.6605402 × 10 -27 kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico) • Peso atómico: promedio por composición isotópica →

Peso molecular

• Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero • Masa más abundante • Masa promedio 17

Carlos Cerveñansky

Masa: definiciones

18

Masa: definiciones

19

100

Determinación del número de cargas (z)

95 90 85 80 75 70 65 60 15 10 5 0 55 50 45 40 35 30 25 20 524.3

525.3

Una sola carga: Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu 526.2

520 521 522 523 524

m/z

525 526 527 528 529 20

100

Determinación del número de cargas (z)

95 90 85 80 75 70 65 60 15 10 5 0 55 50 45 40 35 30 25 20 262.6

263.1

Delta = 0.5 amu 263.6

Delta = 0.5 amu Dos cargas: Delta = 0.5 amu 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 21

m/z

Espectrometría de masa de proteínas

37 kDa 37136 amu 22

Espectrometría de masa

Los Iones son importantes

En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z:

[M+H]

+

o

[M-H]

-

De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H] 2+ , [M+nH] n+ )

[M+Na]

+ ,

[M+K]

+ ,

[M+NH

4

]

+ ,

[M+Cl]

De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M] *+ , [M] * (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común) 23

Espectrometría de masa

M

(péptido)

= 1162 Da

Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1 24

Espectrometría de masa

Espectrómetro de masa

Muestra

Entrada: Volatilización/ Ionización MALDI ESI Analizador de masas TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético Detector Alto Vacío 25

Espectrometría de masa

¿Cómo volatilizar una proteína?

Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes) 26

Espectrometría de masa

Espectrómetros de masa

(configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: FT-MS:

Orbitrap:

ElectroSpray Ionization-Ion Trap ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance ESI-orbitrap 27

Espectrometría de masa

2- MALDI-TOF

28

Espectrometría de masa

Ionización por MALDI:

(Matrix assisted Laser desorption/ionization) ( Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: 29

Ionización por MALDI:

La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador.

Espectrometría de masa El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H + .

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico 30

MALDI-TOF

Espectrometría de masa Matriz: acidos aromaticos 31

Espectrometría de masa 4HCCA DHBA SA 32

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t).

t



(m/z)

1/2

las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa) 33

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico

E

, que le imparte una energía cinética:

E k =

z

eEs

donde s es la distancia de la región de la fuente. s Fuente D

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. E k = zeEs = ½mv 2 E

+ -

 v = (2zeEs/m)

Sin E, iones a la deriva

Fig. Separación por TOF + + ½ s Fuente D Detector 35

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma E k , v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D 

m/z = 2eEs(t/D) 2

36

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

E

+ -

Sin E, iones a la deriva

Fig. Separación por TOF + + s Fuente D ½mv 2 = zeEs  v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D  m/z = 2eEs(t/D) 2 Detector 37

4-25 kV Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector

Carlos Cerveñansky

38

4-25 kV Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t

Carlos Cerveñansky

39

MALDI-TOF

Espectrometría de masa Generalmente se observa la especie monocargada (M+H) + 40

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM 41

MALDI-TOF

Espectrometría de masa Se pueden estudiar masas en un amplio rango 42

Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1= > BC= > RSM10000= > MC= > MC= > MC[BP = 1672.8, 3222] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1655.0

1662.2

1669.4

1676.6

Mass (m/z ) Voyager Spec #1= > BC= > NR(2.00)= > MC= > MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918

100 90 40 30 20 10 80 70 60 50 0 1655.0

Carlos Cerveñansky

1662.2

1669.4

Mass (m/z ) 1676.6

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1683.8

0 1691.0

3222.3

1.6E+ 4

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

1683.8

0 1691.0

43

Espectrometría de masa

3- ESI-MS

44

Espectrometría de masa

ESI

ElectroSpray Ionization Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N 2 (gas secante).

N 2 El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray) 45

Espectrometría de masa

ESI

ElectroSpray Ionization Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador N 2 46

Espectrometría de masa

ESI-Q

Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.

Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas 47

Espectrometría de masa

ESI-Q

Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000 48

Trampa de iones

Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.

Espectrometría de masa 49

Espectrometría de masa

ESI-MS

La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1) 50

ESI y carga

[M+2H] 2 +

674.7

100

Substance P

% 0 300 400 462.8

500 600.4

666.1

685.7

693.6

600 700 800 900 1000 1100 1200

[M+H] +

1347.7

Da/e 1300

ESI-MS

14+ 13+ 12+ Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 52

ESI-MS

14+ 13+ 12+ Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 53

ESI-MS

Espectrometría de masa Deconvolución del espectro

(n+1) + n +

x 1 x 2  = (M+n)/n = (M+n+1)/(n+1) n = (x 2 -1)/(x 1 -x 2 ) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328 54

ESI-MS

Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo 55

ESI-MS

Bajo PM Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Alto PM 56

ESI-MS

Espectrometría de masa Resolución de varias especies 57

Espectrometría de masa

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF

Cyt C 58

Cargas/ion Rango de m/z Rango de masas Interacciones no covalentes MS/MS Acoplar LC Espectrometría de masa

Comparación

MALDI-TOF

Pocas, en general 1 50000 200.000

No

ESI-(Q3 o IT)

Muchas 3000 70.000

Si limitado, PSD No Si, CID Si Tolerancia a contaminantes Si No 59

Espectrometría de masa

Conclusión

Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas 60

Continuará…

61

Lucía Turell Seroalbúmina humana +56 +54 +55 +52 +53 +49 +51+50 +48 +47 +46 +45 +44 62

Lucía Turell Seroalbúmina humana 8x10 6 6x10 6 4x10 6 2x10 6 0 66300 66437 66453 66469 66400 66500 Masa (Da) 66600 63