Transcript 3B-Preparazione dei campioni

Microscopi e tecniche
Microscopiche
2 parte
• Taglio per mezzo
di un microtomo, che
produce sezioni dello
spessore di 1-10mm.
• Montaggio delle
sezioni su vetrini per
microscopia.
Sezione non colorata
Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa
consistenza può essere problematico
-Ecco perché occorre INCLUDERE
-Esistono diversi mezzi di inclusione che
conferiscono diversa consistenza ai campioni.
PARAFFINA
RESINA
MIX DI PARAFFINA E RESINE
• Colorazione delle sezioni con il
metodo più appropriato.
– I coloranti sono a base acquosa, per cui si
elimina lo xilene attraverso passaggi in
etanolo.
Colorazione automatizzata
Colorazioni
• Colorazione
con un
colore brillante di certe
componenti del tessuto
• Contro colorazione
del resto del tessuto con
un colore contrastante
Ematossilina/Eosina
• Ematossilina
ha affinità per
le molecole cariche
negativamente (DNA, RNA ed
alcune proteine).
• Eosina
ha affinità per le
molecole cariche positivamente
(proteine del citosol).
Perchè questa "slide" è
blu …
• Se una porzione di
tessuto o di una cellula
si colora di blu/porpora,
viene detta basofila
• È colorata
dall'ematossilina
• Nuclei e ribosomi
generalmente sono
basofili
… e questa rossa ?
• Se una porzione si
colora in rosso
/arancio /rosa, viene
detta acidofila o
eosinofila
• È colorata dall'eosina
• Sono proteine del citosol
• PAS
Altre colorazioni
– Per sostanze ricche in
zuccheri (muco)
• Tricromica
(Azan Mallory) *
– Per i tessuti
connettivi
– Le fibre si colorano in
blu
• Con E&E sono rosa.
Adiposo Bianco
Le aree bianche sono lipidi
• Osmio o Sudan black
– Per grasso /lipidi/mielina
– I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
Mielina
• Argento ed oro
– Per fibre delicate e
processi cellulari
• Giemsa
Cellule nervose
– Per le cellule del sangue
– Simile ad E&E
Cellule del sangue
Come si osserva il campione?
• Attraverso un
buon microscopio
ottico
• Fotografandolo
• Misurandolo
Per avere un'idea delle
dimensioni delle
strutture osservate si
può usare come
riferimento un
eritrocita (˜ 8 micron)
Interpretate il
campione!!!
• Dovete pensare in 3 dimensioni
• Sezioni seriali sono l'ideale per
l'interpretazione e la ricostruzione
Ricostruzione per mezzo di
sezioni seriali
Microscopia Elettronica a
Trasmissione
• Elettroni hanno una
lunghezza d'onda corta
– Alta risoluzione
• Sezioni molto sottili e
coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano
attraverso il campione
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm
Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene
proiettato su uno schermo che trasforma in toni di
grigio il numero di elettroni da cui viene colpito.
Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti,
ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare
le traiettorie degli elettroni verso l'asse.
La maggiore risoluzione del
TEM permette di
visualizzare strutture non
visibili con il microscopio
ottico
Risoluzione dell'occhio:
0.2 mm = 200 µm
Risoluzione del MO:
2,000 Angstroms = 200nm
Risoluzione del TEM:
2 Angstroms
1 mm = 1000 µm
1 µm = 1000 nm
1 nm = 10 Angstroms
Pinocitosi
Microscopia elettronica
-I campioni devono essere molto più sottili di
quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa
-Non vengono usati coloranti ma sostanze dense
agli elettroni semplicemente per dare contrasto o
anche per marcare anticorpi
Cellula eucariotica
Nucleo interfasico
Preparatione
del campione
• Fissazione
• glutaraldeide
• Tetrossido osmio
• Deidratazione
• etanolo (passaggi)
• Inclusione
• Resine plastiche
• Taglio
• ultramicrotomo
(spessore 50-100
nm)
• Colorazione
• Metalli pesanti
Preparazione di Campioni
Biologici per TEM
• 1 Acquisizione del campione e
taglio in pezzi (1cm3)
• 2 Fissaggio del campione con
glutaraldeide e poi tetrossido di
osmio
– L’osmio è un metallo pesante che si lega ai
lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)
– Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni
appaiono chiari.
Disidratazione dei
campioni tramite
passaggi in soluzioni
a concentrazione
crescente di etanolo.
Inclusione dei campioni
in piccoli blocchi di
resina.
Taglio dei campioni inclusi con un
ultra-microtomo dotato di lama
al diamante (a volte vetro).
– La superfice da analizzare deve
essere di circa 0.2 mm.
– Lo spessore della sezione varia da
40 a 100 nm (di solito 65-80
nm).
Montaggio delle sezioni
su di una griglia.
Colorazione delle sezioni
con nitrato o acetato
di uranile e citrato di
piombo.
Visualizzazione al TEM
Fotografia, sviluppo ed
analisi delle immagini
Vari tipi di
Microscopia
Elettronica
• Transmissione (TEM)
• Scansione (SEM)
• Shadow-casting
• Freeze-fracture
• Freeze-etching
• CryoEM
• Negative Staining
Microscopia Elettronica a
Scansione
• SEM fa una
scansione
della
superfice del
campione
• Produce
immagini 3-D
IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A
SCANSIONE (SEM)
Nel SEM (ed in genere nella microscopia
elettronica) viene sfruttata l’interazione di un
fascio di e- con il campione per ricavare
informazioni sul campione stesso come nel
microscopio luce a riflessione viene utilizzato un
fascio di fotoni
Non vengono registrati gli e- che
attraversano il campione bensì quelli secondari
che sono emessi a seguito dell’urto del fascio
di elettroni contro di esso
Tridimensionalità
La caratteristica preminente delle immagini
ottenute con il SEM è l’eccezionale
tridimensionalità
- Ciglia e microvilli
Glomerulo renale
Preparazione dei campioni per
SEM
• Acquisizione del
campione
– Trattandolo con cura in modo
da non danneggiare la
superficie
• Fissazione e disidratazione
• Non si include
• Poggiato su di un
supporto e ricoperto
con um metallo
– Oro, cromo, palladio,
carbone
– Deve essere
elettron-conducente
(non elettrondenso)
• Visualizzato al
microscopio
• Fotografato
• Si possono
analizzare le
componenti chimiche
tramite raggi X