Transcript 3 קביעת קצה קרבוקסילי: קרבוקסיפפטידאזות

‫תרגול מס' ‪ :3‬קביעת הרכב ורצף‬
‫של חומצות אמינו בפפטיד‪/‬חלבון‬
‫•‬
‫קביעת הרכב וכמות חומצות אמינו‪.‬‬
‫•‬
‫קביעת קצה אמיני‪ :‬שיטת אדמן או סנגר‪.‬‬
‫•‬
‫קביעת קצה קרבוקסילי‪ :‬קרבוקסיפפטידאזות‪.‬‬
‫•‬
‫קביעת רצף בתוך הפפטיד‪ :‬ריאקציות ביקוע שונות‪.‬‬
‫קביעת הרכב וכמות של חומצות אמינו‬
‫הרכב‬
‫ח‪ .‬אמינו‬
‫‪Ninhydrin‬‬
‫‪reaction‬‬
‫קבלת כמות‬
‫מולרית של כל‬
‫ח‪.‬א‪.‬‬
‫כימות כל‬
‫שבפוליפפטיד חומצה אמינית‬
‫בנפרד‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫תערובת‬
‫ח‪ .‬אמינו‬
‫פוליפפטיד‬
‫‪Ion Exchange‬‬
‫‪chromatography‬‬
‫‪6M HCl‬‬
‫‪110°, 24h‬‬
‫הפרדת חומצות‬
‫האמינו השונות‬
‫פירוק הקשרים‬
‫הפפטידיים‬
‫והדיסולפידים‬
‫‪ .2‬קביעת קצה אמיני‪ :‬ראגנטים הניקשרים קוולנטית לאמין ראשוני‪.‬‬
‫א‪ .‬ראגנט סאנגר )‪FDNB (Sanger reagent‬‬
‫שיטה לקבוע את הקצה האמיני בלבד‬
‫‪FDNB‬‬
‫‪DNB‬‬
‫הידרוליזה‬
‫חומצית‬
‫‪DNB‬‬
‫במהלך ההידרוליזה החומצית הפפטיד עובר דגרדציה לכל‬
‫מרכיביו‬
‫ולכן לא ניתן לסמן במחזוריות אלא רק פעם אחת ‪.‬‬
‫אם יש בחלבון תתי‪-‬יחידות עם חומצות אמינו שונות בקצה‬
‫– נקבל אינפורמציה על כך‪.‬‬
‫‪+ FDNB‬‬
‫‪H3+N‬‬
‫ב‪ .‬שיטת אדמן קביעת רצף פפטידים (‪)Edman’s degradation‬‬
‫ריאגנט אדמן ניקשר קוולנטית לקבוצות אמין ראשוניות‪.‬‬
‫בחלבון הוא ייקשר בד"כ לקצה האמיני של השרשרת‬
‫הפוליפפטידית‪ .‬לאחר ההידרוליזה החומצית שאר החלבון נשאר‬
‫שלם‪ .‬שיטה זו טובה לריצוף עד ‪ 50‬ח‪.‬א‪.‬‬
‫הידרוליזה חומצית עדינה‬
‫‪ .3‬קביעת קצה קרבוקסילי‪:‬‬
‫קרבוקסיפפטידאזות‪:‬‬
‫•‬
‫חותכים ח‪ .‬אמינו מהקצה הקרבוקסילי של הפפטיד‪.‬‬
‫•‬
‫כאשר שמים אנזים לזמן קצר הוא יבצע רק ביקוע אחד וישחרר את החומצה‬
‫האמינית האחרונה‪.‬‬
‫קרבוקסיפפטידאז ‪: A‬‬
‫•‬
‫יוריד כל חומצה אמינית אחרונה למעט ‪:‬‬
‫‪Pro, Arg, Lys‬‬
‫כלומר אם השתמשנו באנזים ולא קיבלנו תוצר ביקוע – אחת מהשלושה נמצאת‬
‫בקצה הקרבוקסילי‬
‫קרבוקסיפפטידאז ‪: B‬‬
‫•‬
‫יוריד כל חומצה אמינית אחרונה למעט ‪:‬‬
‫‪. Arg, Lys‬‬
‫‪ .4‬קביעת רצף בתוך הפפטיד‪:‬‬
‫שיטות לביקוע חלבונים לפפטידים באופן ספציפי – ביקוע אנזימטי‬
‫טריפסין ‪:‬‬
‫חותך אחרי‬
‫(בצד‬
‫הקרבוקסילי‬
‫של‪ )....‬ליזין או‬
‫ארגינין –‬
‫חומצות אמינו‬
‫טעונות חיובי‬
‫כימוטריפסין ‪ :‬חותך‬
‫אחרי (בצד הקרבוקסילי‬
‫של‪ )....‬טירוזין‪,‬‬
‫טריפטופן ופנילאלנין –‬
‫חומצות אמינו ארומטיות‬
‫‪ .4‬קביעת רצף בתוך הפפטיד‪:‬‬
‫שיטות לביקוע חלבונים לפפטידים באופן ספציפי – ביקוע כימי‬
‫ציאנוגן ברומיד‪:‬‬
‫חותך אחרי‬
‫(בצד‬
‫הקרבוקסילי‬
‫של‪ )....‬שיירי‬
‫מתיונין‬
‫קביעת רצף חלבונים –‬
‫‪ .1‬ביקוע שרשרת החלבון לפפטידים קצרים‪.‬‬
‫‪ .2‬ריצוף כל פפטיד בניפרד בשיטת אדמן‪.‬‬
‫‪ .3‬עריכת החלבון לפי רצפים חופפים שזוהו‪.‬‬
‫שאלה מס' ‪:21‬‬
‫נתון‪ :‬המשקל המולקולרי של ‪ X‬בסביבות ‪650‬‬
‫‪ ~ 6 a.a.‬‬
‫מסקנה‪ :‬הפפטיד מכיל כ‪ 6-‬חומצות אמינו‪:‬‬
‫‪650 Da‬‬
‫‪110 Da‬‬
‫‪a .a .‬‬
‫נתון‪ :‬הפפטיד מכיל כמויות מולריות שוות של אלאנין‪ ,‬חומצה אספרטית וטירוזין‬
‫מסקנה‪ :‬נצפה שיהיו בפפטיד שתי ח‪.‬א‪ .‬מכל סוג‪(2Ala,2Asp,2Tyr).‬‬
‫נתון‪ :‬בשיטת סנגר התקבל התוצר ‪-DNB‬אלנין‪.‬‬
‫מסקנה‪ :‬החומצה האמינית הראשונה בפפטיד היא‪Ala :‬‬
‫נתון‪ :‬טיפול ממושך בפפטיד ‪ X‬בכימוטרפסין הביא ליצירת שני פפטידים ‪ A‬ו‪ B-‬שני הפפטידים החדשים הכילו גם‬
‫אלנין‪ ,‬חומצה אספרטית וטירוזין‪.‬‬
‫מסקנה‪ :‬טירוזין אחד נמצא בקצה הקרבוקסילי (אחרת היינו מקבלים שלושה מקטעים) וטירוזין נוסף נמצא באמצע‬
‫כי קיבלנו ‪ 2‬שלשות‬
‫נתון‪ :‬טפול ב‪ A -‬בשיטת סנגר נתן ‪ -DNB‬אספרטית‪ ,‬וטיפול ב‪ B-‬נתן ‪ DNB‬אלנין‬
‫‪Ala, Asp, Tyr‬‬
‫‪COO-‬‬
‫‪Tyr‬‬
‫‪6‬‬
‫‪Ala, Asp, Tyr‬‬
‫‪Ala‬‬
‫‪Asp‬‬
‫‪Tyr‬‬
‫‪Asp‬‬
‫‪Ala‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪NH3+‬‬
‫שאלה מס' ‪:23‬‬
‫בהידרוליזה חומצית של פפטיד התקבלו החומצות האמיניות הבאות‪:‬‬
‫‪Gly+Ala+2Cys+Arg+Glu+Ile+Thr+Phe+Val‬‬
‫בחיזור הפפטיד המקורי עם מרקפטואתנול ואלקילצית שיירי הציסטאין עם יודואציטט התקבלו ‪ 2‬פפטידים קטנים יותר (‪.)B+A‬‬
‫הצע מבנה לפפטיד לפי הנתונים הבאים‪:‬‬
‫פפטיד ‪:A‬‬
‫נתון‪ :‬מכיל ‪Ala, Gly, Cys, Glu, Arg, Ile‬‬
‫נתון‪ :‬קרבוכסיפפטידז ‪ A‬שחרר ‪( Ile‬קרבוכסיפפטידז ‪ A‬מוריד כל ח"א אחרונה למעט ‪( Pro, Arg, Lys :‬‬
‫מסקנה‪ Ile :‬נמצאת בקצה הקרבוקסילי‬
‫נתון‪ :‬בטפול בריאגט ‪ EDMN‬התקבלו ‪PTH-Gly‬‬
‫מסקנה‪ Gly :‬בקצה האמינו טרמינלי‬
‫נתון‪ :‬בטפול בטריפסין התקבלו ‪ 2‬פפטידים‪ ,‬האחד הכיל ‪ Gly+Ala+Cys+Arg‬והשני הכיל ‪.Glu+Ile‬‬
‫מסקנות‪ )1 :‬מיקום ה ‪Arg -‬‬
‫‪ )2‬מיקום ה ‪Glu -‬‬
‫נשאר לקבוע את מיקום ‪ Ala‬ו‪Cys-‬‬
‫‪Ile‬‬
‫‪COO‬‬‫‪6‬‬
‫‪Glu‬‬
‫‪5‬‬
‫‪Arg‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Cys‬‬
‫‪Ala‬‬
‫‪Ala‬‬
‫‪Cys‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Gly‬‬
‫‪1‬‬
‫‪+‬‬
‫‪NH3‬‬
‫פפטיד‬
‫‪:B‬‬
‫מכיל ‪Thr+Val+Cys+Phe‬‬
‫נתון‪ :‬קרבוקסיפפטידאז ‪ A‬שיחרר ‪Val‬‬
‫מסקנה‪ Val :‬נמצאת בקצה הקרבוקסילי‬
‫נתון‪ :‬כימוטריפסין שחרר ‪ Val‬וטריפפטיד המכיל ‪Cys, Thr, Phe‬‬
‫מסקנה‪ Phe :‬נמצאת לפני ה‪Val -‬‬
‫נתון‪ :‬בדגרדציית אדמן התקבל ‪PTH-Thr‬‬
‫מסקנה‪Thr :‬בקצה האמינו טרמינלי – ‪ Cys‬אחריה‬
‫‪COO-‬‬
‫‪Ile‬‬
‫‪Glu‬‬
‫‪Cys‬‬
‫‪Arg‬‬
‫‪Ala‬‬
‫‪Gly‬‬
‫‪s‬‬
‫‪s‬‬
‫‪COO-‬‬
‫‪Val‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Phe‬‬
‫‪3‬‬
‫‪Cys‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Thr‬‬
‫‪1‬‬
‫‪NH3+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪NH3‬‬
‫שאלה מס' ‪:22‬‬
‫בהידרוליזה חלקית של חלבון התקבלו מספר פוליפפטידים‪ .‬אחד מהם בודד‪ .‬קבע את רצף החומצות האמיניות בפוליפפטיד זה‬
‫מתוך הנתונים הבאים‪:‬‬
‫א) נתון‪ :‬בהידרוליזה חומצית ובסיסית מלאות התקבלו‪Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro :‬‬
‫מסקנה‪ :‬סה"כ ‪ 9‬חומצות אמינו בפפטיד‬
‫ב) נתון‪ :‬בטיפול ב‪ FDNB -‬ואח"כ הידרוליזה חומצית מלאה נגזרות ה‪ DNB -‬שהתקבלו היו‪DNB-Ala+ DNB- :‬‬
‫‪Lys‬‬
‫מסקנה‪ :‬מריאקצית סנגר לא קיבלנו תשובה סופית לגבי החומצה האמינו הראשונה‪ .‬ח‪ .‬אמינו ראשונה תהיה‬
‫‪ Ala‬או ‪.Lys‬‬
‫ג) נתון‪ :‬קרבוכסיפפטידז ‪ A‬לא משחרר כל חומצה אמינית מהקצה ‪C -‬‬
‫מסקנה‪ :‬קרבוקסיפפטידאז ‪ A‬אינו מוריד את חומצות האמינו ‪ Arg ,Pro‬ו‪ .Lys -‬מכיוון שהוא לא משחרר אף‬
‫חומצה ניתן להסיק כי החומצה האחרונה בפוליפפטיד היא אחת מהשלושה‬
‫ד) נתון‪ :‬בטפול בציאנוגן ברומיד )‪(CNBr‬התקבלו שני פפטידים האחד הכיל ‪ PRO+TRP+SER‬והשני את כל‬
‫החומצות האמיניות הנותרות‪.‬‬
‫‪NH3+ Ala/Lys‬‬
‫‪COO‬‬‫‪9‬‬
‫‪8‬‬
‫‪7‬‬
‫‪6‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫מסקנות‪ )1 :‬ציאנוגן ברומיד מבקע רק אחרי ‪ .Met‬לפי ב' הפפטיד הקצר יותר שמכיל ‪ Trp ,Pro‬ו‪ Ser -‬לא‬
‫יכול להיות בקצה האמינו טרמינלי של הפוליפפטיד ולכן יהיה בקצה הקרבוקסילי‪ .‬ולכן ‪ Met‬תהיה החומצה‬
‫הרביעית מהקצה הקרבוקסילי‪.‬‬
‫‪ )2‬ומ‪-‬ג' ניתן לומר כי החומצה האחרונה היא ‪Pro‬‬
‫ה) נתון‪ :‬בטיפול בכימוטרפסין התקבלו ‪ 3‬פפטידים‪ .‬האחד הכיל רק ‪ PRO+SER‬השני הכיל רק ‪TRP+MET‬‬
‫והשלישי הכיל ‪.ALA+ARG+SER+LYS+PHE‬‬
‫מסקנות‪ )1 :‬כימוטריפסין מבקע רק אחרי ח‪ .‬אמינו ארומטיות‪ .‬הפפטיד שמכיל רק ‪ Ser‬ו‪ Pro -‬חייב להיות‬
‫בקצה הקרבוקסילי – ומכאן ש‪ Ser -‬היא הח‪ .‬האמינו שנייה מהסוף‪.‬‬
‫‪ )2‬הפפטיד שמכיל ‪ Met‬ו‪ Trp -‬מלמד אותנו על מיקומה של ‪ Trp‬כשלישית מהקצה הקרבוקסילי‪.‬‬
‫‪ )3‬הפפטיד השלישי שהתקבל יכול ללמד אותנו על מיקומה של ‪ Phe‬הארומטית – חמישית מהקצה האמינו‬
‫טרמינלי‬
‫‪Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro‬‬
‫‪Pro COO‬‬‫‪9‬‬
‫‪Ser‬‬
‫‪Trp‬‬
‫‪Met‬‬
‫‪Phe‬‬
‫‪8‬‬
‫‪7‬‬
‫‪6‬‬
‫‪5‬‬
‫‪NH3+ Ala/Lys‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫ו) בטפול בטרפסין התקבלו ‪ 3‬פפטידים‪ .‬האחד הכיל רק ‪ ,ARG+ALA‬השני הכיל ‪LYS+SER‬‬
‫והשלישי הכיל ‪.PRO+SER+MET+TRP+PHE‬‬
‫מסקנות‪ )1 :‬טריפסין מבקע רק אחרי ‪ Lys‬ו‪ .Arg -‬אם ‪ Lys‬היתה החומצה הראשונה בפוליפפטיד‪,‬‬
‫מטריפסין היינו מקבלים רק שני פפטידים‪ ,‬מכיוון שקיבלנו שלושה פפטידים אחרי ביקוע עם טריפסין – נוכל להסיק‬
‫כי ‪ Ala‬היא החומצה הראשונה‬
‫‪ )2‬מכיוון ש‪ Ala -‬מתקבלת בפפטיד עם ‪ ,Arg‬נסיק כי ‪ Arg‬היא החומצה השניה‬
‫‪ )3‬על מנת שנקבל את הפפטיד השני ‪ Ser‬צריכה להיות החומצה השלישית ו‪Lys -‬‬
‫הרביעית‪.‬‬
‫‪Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro‬‬
‫‪Pro COO‬‬‫‪9‬‬
‫‪Ser‬‬
‫‪Trp‬‬
‫‪Met‬‬
‫‪Phe‬‬
‫‪Lys‬‬
‫‪Ser‬‬
‫‪8‬‬
‫‪7‬‬
‫‪6‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪Arg‬‬
‫‪2‬‬
‫‪NH3+ Ala/Lys‬‬
‫‪1‬‬