Transcript lac Z

Chap III
Régulation de l’expression des gènes
L’opéron lactose
La bactérie E. coli utilise le lactose comme source de carbone…
Densité Optique
Source de carbone = glucose
Source de carbone = lactose
temps
…mais moins efficacement que la glucose
Métabolisme du glucose et lactose
Lactose
Glucose
Perméase au lactose
perméase glucose
Membrane bactérienne
Lactose
β-galactosidase
Glucose
+
Galactose
Glucose
Glycolyse
Energie + Carbone
Croissance
L’utilisation du lactose implique les mêmes enzymes que celles nécessaires
pour le glucose mais aussi une perméase et la β-galactosidase
Analyse génétique du métabolisme du lactose
 Recherche de mutants incapables d’utiliser le lactose : phénotype [lac-]
Mutagenèse UV
Glucose
Incubation à 37°C
[lac-]
Glucose
Réplique sur velours
Lactose
Test de dominance
lac+
F’ lac+
lacZ-
Le mérodiploïde (F’(lac+)/lacZ- ) a le phénotype [lac+]
La mutation lacZ- est récessive
Tests de complémentation
lacYF’ lac+
LacZ-
Le mérodiploïde a le phénotype [lac+]
Les mutations lacZ- et lacY- affectent des gènes différents
Conclusion analyse génétique :
2 gènes impliqués dans le métabolisme du lactose : lacZ et lacY
Les mutations sont récessives : perte de fonction du gène
Mutant lacZ- : incapable de métaboliser le lactose quelle que soit la
[C]lactose dans le milieu de culture. Des expériences avec du lactose
radioactif montrent qu’il est transporté dans la cellule. Pas d’activité βgalactosidase : le gène lacZ code la β-galactosidase
Mutant lacY- peut métaboliser le lactose si [C]lactose dans le milieu de
culture est forte. L’activité β-galactosidase est alors normale (même
paramètres cinétiques que la β-galactosidase sauvage) : le gène lacY
code la perméase au lactose.
Les analyses de croisements entre les mutants montrent que ces deux
gènes sont très proches l’un de l’autre.
lac Z
lac Y
L’induction :
En absence de lactose dans le milieu de culture, pas d’activité β-galactosidase
détectable : il existe un inducteur
 le lactose lui même?
 produit de dégradation du lactose?
L’IPTG, isopropyl thiogalactoside est un analogue non métabolisable du
lactose. Il n’est donc pas clivé par la β-galactosidase ; pourtant c’est un
inducteur de l’expression de la β-galactosidase : on parle d’inducteur gratuit
Les mutants constitutifs
Chez ces mutants, en présence de glucose comme seule source de
carbone, la β-galactosidase est produite : perte d’induction ; les souches
sont toujours de phénotype [lac+], car toujours capables de dégrader le
lactose
Mutant lacIMutation récessive (pas de β-galactosidase produite dans une souche
F’(lacI-)/lacI+) = dans la souche lacI-, la protéine codée par lacI n’est pas
fonctionnelle
En l’absence de la protéine LacI, les gènes lacZ et lacY sont transcrits
quand il y a du glucose comme seule source de carbone.
La protéine LacI est donc un répresseur. Ce répresseur ne fonctionne que
quand il n’y a pas de lactose
lac I
lac Z
lac Y
Effet direct?
BASE DU RAISONNEMENT EN GENETIQUE
Les mutants constitutifs 2 :
Le mutant Oc
Le mutant Oc a un phénotype constitutif
L’allèle Oc présente une relation de dominance/récessivité originale vis
à vis de l’allèle sauvage pour le phénotype constitutif !
Génotype
Activité βgalactosidase
Phénotype
Dominance
F’(lacOc,lacZ+)/lacO+,lacZ-
Constitutive
[lac+]
lacOC dominant/ lacO+
F’(lacOc,lacZ-)/lacO+,lacZ+
Inductible
[lac+]
lacO+ dominant/ lacOC
 ???????????????
Activité
β-Galactosidase
Mutant :
lac I
OC
lac Z+
OC
lac Z+
constitutive
Mérodiploïde 1 :
lac I
constitutive
lac I
O+
lac Z-
OC
lac Z-
Mérodiploïde 2 :
lac I
inductible
lac I
O+
lac Z+
Chaque fois que Oc et lacZ+ sont sur le même brin d’ADN (en cis),
Le phénotype est constitutif; idem avec lacY+
La mutation Oc est cis-dominante
L’opérateur lacO
lac I
O+
lac Z
lacY
Transcription
Traduction
La région lacO est le site de fixation du répresseur. Dans le mutant
lacOc, le répresseur LacI est incapable de se fixer sur l’opérateur, d’où
l’absence de répression et le phénotype constitutif. lacO est donc une
séquence d’ADN reconnue par une protéine
Mutants non inductibles 1:
la région P (promoteur)
Ces mutants ont un phénotype [lac-] :
-
La mutation lacP est cis-dominante : lacP est le promoteur, site de fixation
de l’ARN polymérase (sous unité σ)
lac I
P
σ
O+
lac Z
lacY
Mutants non inductibles 2:
s
Le mutant lacI
Activité
β-Galactosidase
s
La mutation lacI est dominante : en présence de lactose( )
lacIs
P
O+
lac Z-
Non inductible
[lac-]
lac I +
P
O+
lac Z+
Non actif en présence de lactose
lactose
s
L’allèle lacI est un répresseur « super actif ». Contrairement à la protéine
LacI, LacIs est incapable de fixer le lactose
Un premier modèle : l’opéron
Un ensemble de gènes régulés par un opérateur
En absence de lactose :
lac I
P
O+
lac Z
lacY
lacA
Transcription
Traduction
En présence de lactose :
σ
lac I +
P
O+
lac Z
lacY
Non actif en présence de lactose
lactose
lacA
Un seul ARNm, 3 protéines : ARNm polycistronique
lac I
P
O+
lac Z
lacY
lacA
σ
perméase
β-galactosidase
acétylase
Croissance dans un milieu contenant du glucose ET de lactose
Densité Optique
temps
Le glucose empêche l’utilisation
des autres sucres (même
phénomène avec le maltose) :
répression catabolique.
Le modèle proposé n’explique pas
cela…
Recherche de mutants qui « miment » l’effet du glucose
 Le mutant pousse sur glucose
 il ne pousse pas sur lactose, car « il croit » qu’il existe du glucose dans le
milieu de culture
 il ne pousse pas sur maltose, car « il croit » qu’il existe du glucose dans le
milieu de culture
Recherche de mutants qui « miment » l’effet du glucose
2 groupes de complémentation (2 gènes)
Mutations récessives (perte de fonction des gènes)
 mutant cya1- : adénylate cyclase :
- en absence d’AMPc, la cellule pense qu’il y a du glucose dans le milieu; pas de
transcription de l’opéron lactose
 mutant cap1- ou crp1- : catabolic activator protein1 (ou cAMP Receptor Protein 1)
- en absence de CRP1, la transcription de l’opéron lactose est abolie dans les
conditions où normalement lacZ, lacY et lacA sont transcrits : la protéine CRP est un
activateur de la transcription.
La protéine CRP1 fixe l’AMPc; la fixation de l’AMPc lui permet de se fixer sur l’ADN à
proximité du promoteur
Les régions promoteur et opérateur de l’opéron lactose
GTGAGTTAGCTCACTCA
CACTCAATCGAGTGAGT
TGTG-GAA-TTGTGAGCGGATAACAATTTCACA
ACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT
Interaction de CRP avec le promoteur
La protéine CRP agit sous forme dimérique
La protéine CRP recrute l’holoenzyme
En présence de glucose et lactose
Lactose
Glucose
Perméase au lactose
perméase glucose
Membrane bactérienne
Lactose
β-galactosidase
Glucose
+
Galactose
cya
Glucose
Glycolyse
σ
CRP1
lac I +
P
O+
lac Z
lacY
lacA
Transcription de
l’opéron lactose très
faible
En absence de glucose
Lactose
Perméase au lactose
perméase glucose
Membrane bactérienne
Lactose
β-galactosidase
Glucose
+
Galactose
cya
Glucose
ATP
AMPc + PP
Glycolyse
CRP1
CRP1
σ
CRP1
lac I +
P
O+
lac Z
lacY
lacA
opéron lactose actif
L’opéron lactose
Régulation négative par un répresseur :
en absence de lactose, le répresseur est fixé sur l’opérateur et maintient la
transcription dans un état réprimé.
En présence de l’inducteur (lactose), le répresseur est inactivé et quitte
l’opérateur: c’est l’induction
Régulation positive par un activateur :
En absence de glucose, [AMPc] est forte. La protéine CRP fixe l’AMPc et
devient capable de reconnaître une région proche du promoteur. Elle interagit
avec l’ARN pol et facilite sont recrutement en -10 et -35 du promoteur.
Le modèle opéron de Jacob et Monod : établi d’après l’opéron lactose
Un opéron comprend un certain nombre de gènes régulés par un seul
promoteur et éventuellement un opérateur. L’ARNm produit est polycistronique.
L’expression des gènes contenus dans l’opéron nécessite l’interaction entre des
séquences cis (promoteur et opérateur) et des séquences trans (facteurs de
transcription).
L’opéron tryptophane
Il contrôle l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de tryptophane
Concentration en enzyme
du métabolisme du trp
Pas de Trp
Dans le milieu
Trp disponible
dans le milieu
Enzyme
Temps
La cellule évite de synthétiser les enzymes responsables de la biosynthèse de
trp quand cet acide aminé est disponible dans le milieu
Pas de tryptophane dans le milieu
aporépresseur
trpR
Gènes de structure
P O
trpL
trpE
trpD
trpB
trpC
trpA
Biosynthèse du trp
Beaucoup de tryptophane dans le milieu
corépresseur
(tryptophane)
aporépresseur
trpR
répresseur
Gènes de structure
P O
trpL
trpE
trpD
trpC
trpB
trpA
Un peu de tryptophane dans la cellule
Mauvaise répression car peu de co-répresseur
aporépresseur
trpR
Gènes de structure
P O
trpL
trpE
trpD
trpC
trpB
ARNm « atténué »
 Inhibition de l’élongation de la transcription : l’atténuation
trpA
4
3
2
UUUUUUU
1
3
2
Lorsque la boucle 1/2 se forme, la
boucle 3/4 peut aussi se former.
 La boucle 3/4 a la structure d’un
terminateur de transcription.
1
Structure de l’ARNm atténué
4
UUUUUUU
Lorsque la boucle 2/3 se forme,
ni la boucle 1/2, ni la boucle 3/4
ne peuvent se former.
La boucle 2/3 est la moins stable
des boucles
L’atténuation
Suffisamment de tryptophane
disponible pour la traduction
Seul l’ARNm atténué est produit
Le tryptophane disponible pour la
traduction est en quantité limitée
 L’opéron trp est transcrit
C’est la vitesse de traduction du ribosome qui conditionne l’arrêt de la transcription
L’opéron tryptophane un double système de régulation
 lors de l’initiation de la transcription : ce système détecte une concentration
globale de trp dans la cellule et agit par un répresseur.
lors de l’élongation de la transcription : ce système détecte la quantité de
tryptophane disponible pour la traduction en mesurant la vitesse de passage des
ribosomes au niveau des codons trp. Ce système fonctionne par un mécanisme
d’atténuation qui implique un couplage transcription/traduction.
L’atténuation est impossible chez les eucaryotes.
Régulation de l’initiation de la transcription chez les eucaryotes
 La RNA polII est incapable de reconnaître les promoteurs; l’initiation de la
transcription nécessite des facteurs généraux (TFII’s) présents dans tous les
types cellulaires .
TATA
Région transcrite
 La régulation de la transcription est assurée par des séquences cis appelées
enhancers (UAS : activation) ou silencers (URS : repression), sur lesquels se
fixent des facteurs de transcription spécifiques. La position des enhancers et
silencers est relativement indépendante de celle du site l’initiation de la
transcription.
Enhancer ou silencer
Région transcrite
Mise en évidence des régions cis :
méthode gène rapporteur
Activité
Région transcrite
Gène rapporteur
silencer
100%
Gène rapporteur
100%
Gène rapporteur
250%
Gène rapporteur
10%
enhancer
La méthode gène rapporteur permet de définir les zones cis et
d’établir leur fonction (enhancer/silencer)
Les gènes rapporteurs outils en génétique du développement
pour visualiser l’expression d’un gène
La séquence de régulation de la myogénine a été placée en amont du gène rapporteur lacZ
de E.coli chez la souris. Des embryons agés de 11 jours ont été sacrifiés et incubés en
présence de X-gal Toutes les cellules contiennent le gène rapporteur, mais seules un petit
nombre l’expriment