Маяки и лоции в море современных лабораторных инноваций и технологий

Что мы определяем при лабораторных исследованиях?

Genomics (DNA- 35,000 genes) Геномика Transcriptomics (RNA 100,000 mRNA’s) Транскриптомика Proteomics (Proteins - 1,000,000 proteins) Протеомика Metabolomics (2,500 smoll molecules) Метаболомика

Лабораторные методы исследования

1.

2.

3.

Генетические маркеры, кодирующие синтез специфических белков в организме Специфические белки Метаболиты

Протеомика специфические белки

1.

2.

Плазмы крови Органов (клеток) и тканей

Белки тесно связанные с определенными структурами органов и тканей

• •

Чем выше их уровень в крови – тем выраженнее повреждение органа Чем выше их уровень в крови – тем неблагоприятнее прогноз

Белки, отражающие реакцию органов и систем на различные патологические процессы

• • •

Не связаны с патологией определенного органа Чем выше (ниже) их уровень в крови – тем выраженнее патологический процесс Уровень повышения в крови с меньшей степенью вероятности отражает неблагоприятный прогноз

Определение специфических белков используют для:

1.

2.

3.

оценки риска развития сердечно сосудистых заболеваний - определение ультрачувствительного СРБ или аполипопротеинов раннего выявления воспалительного процесса, оценки тяжести больного и прогноза течения заболевания - СРБ или прокальцитонин диагностики острого коронарного синдрома миоглобин, тропонины Т или I

4.

5.

6.

7.

диагностики железодефицитных состояний и анемии - трансферрин, ферритин, растворимый рецептор трансферрина ранней диагностики нарушений статуса питания больных - преальбумин, трансферрин, альбумин диагностики повреждений головного мозга белок S100 раннего выявления диабетической и артериальной нефропатии - альбумин в моче

Иммунология

Проточная цитофлюориметрия с использованием моноклональных антител:

–

иммунофенотипическая характеристика клеток крови для диагностики гемобластозов;

– –

иммунофенотипическая характеристика клеток крови для оценки иммунного статуса и диагностики иммунодефицитов; иммунофенотипическая характеристика стволовых клеток

Иммуногематология

• • • •

Группы крови АВ0 Антигены эритроцитов системы Резус Антигены системы Keлл Антигены системы Даффи (Duffy – антиген Fy), Кидд (Kidd – антиген Jk), MNS (антиген MNS) и Левис (Lewis – антиген Le)

Масс-спектрометрия технология MALDI TOF/MS

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ — (от англ.

MALDI, Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization) — десорбционный метод «мягкой» ионизации , обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. Чувствительность метода: << 1 фемтомоль.

Кандидаты в биомаркеры сердечной недостаточности (предложено более 60 биомаркеров, отражающих различные патогенетические аспекты сердечной недостаточности)

• • • • •

1.

Биомаркеры воспаления: С-реактивный белок (высокочувствительный) Фактор некроза опухолей α и его рецепторы Интерлейкины 1,6,10 и 18 Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (LP-PLA2) Адипонектин

• • • • •

2.

Биомаркеры оксидативного стресса: Окисленные ЛПНП Миелопероксидаза Биопиррины мочи

• •

3.

Биомаркеры ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса: Матричные металлопротеиназы 2,3,9 Тканевые ингибиторы металлопротеиназ Коллагеновые пропептиды Галектин 3

• • • • • • •

4.

Нейрогормоны: Ангиотензин II Альдостерон Вазопрессин/копептин Эндотелин 1 Катехоламины (норадреналин, адреналин) Кардиотропин 1 Новые вазодилататоры (адреномедуллин и средняя часть проадреномедуллина, уротензин II, урокортин)

• • •

5.

Биомаркеры повреждения и апоптоза кардиомиоцитов: Тропонин I и T Легкие цепи миозинкиназы I Белок, связывающий жирные кислоты

• • • •

6.

МВ-фракция креатинкиназы Биомаркеры стресса кардиомиоцитов: Натрийуретические пептиды (предсердного типа, мозгового типа,типа С, N-терминальный пропептид предсердного типа А, про-НПМТ, средняя часть пропептида предсердного типа) Растворимый рецептор ST2 (ST2 является членом семейства рецепторов интерлейкина 1, типичная рецепторная тирозинкиназа) Фактор дифференциации роста 15 (GDF-15)

• • • • • •

7.

Экстракардиальные биомаркеры: Цистатин С β-микроглобулин желатиназа-ассоициированный липокаин нейтрофилов (NGAL) N ацетил- D-глюкозаминаза (NAG) Молекула повреждения почек 1 (KIM-1) трийодтиронин

Что отражают показатели (специфические белки), полученные с помощью современных технологий?

• •

Универсальная дефиниция ИМ Критерии острого ИМ Инфаркт миокарда при CV ≤10%» «выявление повышения и/или снижения значений концентрации кардиомаркера [предпочтительно кардиального тропонина (cTn)], по крайней мере, на одно значение, характерное для 99-ой процентили, соответствующей верхнему референсному значению». Т.е.,«≥ 2 х 99-ая процентиль В дополнение, должен быть, по крайней мере, один из пяти признаков, подтверждающих диагноз ИМ симптомы ишемии изменения ЭКГ, характерные для новой ишемии (новые изменения ST-T), или новая блокада левой ножки пучка Гисса (LBBB); развитие патологических зубцов Q на ЭКГ; «свежая» потеря жизнеспособного миокарда или нарушение региональной подвижности стенки, подтвержденные методами визуализации обнаружение внутрикоронарного тромба при ангиографии или при аутопсии

Чувствительность биомаркеров к повреждению миокарда Infarction Mass vs. Mycardial Marker

ECG CK CK-MB Troponin 5 - 10 g ~0,2 g ~0,02 g ~0,003 g

Marker

Высокочувствительный тропонин

• •

кардиальные тропонины высокочувствительными тестами обнаруживаются почти у 100 % здоровых людей чувствительность методов определения тропонинов повышена в 1000–10 000 раз и теперь нижний предел определения (аналитическая чувствительность) может достигать 90 пкг/л

Алгоритм серийных измерений hs cTn для диагностики ИМ

Правила Ослера: 1.

2.

Диагноз никогда не ставят по одному результату исследования; необходимо установить тенденцию изменения полученных результатов Чем больше степень отклонения результата от референтной величины, тем выше достоверность наличия патологии Sir William Osler, 1904

“The Evolution of Modern Medicine”

Критерии диагностики сахарного диабета (2010 г. Американская Диабетическая Ассоциация):

1.

2.

3.

4.

HbA1c > 6,5 %, или клинические симптомы сахарного диабета и случайно выявленное повышение концентрации глюкозы в плазме крови



11,1 ммоль/л (



200 мг%) или; уровень глюкозы в плазме крови натощак –



7,1 ммоль/л ((



126 мг%) или; через 2 ч после пероральной нагрузки глюкозой (75 г глюкозы) -



11,1 ммоль/л (



200 мг%).

Гликозилированный гемоглобин Измеряется методом катион обменной хроматографии и иммунного анализа Измеряется методом аффинной хроматографии

В 1996 году в США была разработана Национальная программа стандартизации гликозилированного гемоглобина (NGSP).

Ужесточение критериев NGSP:

• • •

1996 год – точность <5% в диапазоне 4-14% 2002 год - точность <4% в диапазоне 4-14% 2007 год – bias ± 0,85% HbA1c в диапазоне 4-12%

•

2010 год - bias ± 0,75% HbA1c в диапазоне 4-10% Точность степень близости результата измерений к принятому опорному значению Bias смещение (неправильность средства измерения) - систематическая погрешность в показании средства измерений

1.

Методы определения специфических белков: Электрофорез, включая капиллярный 2.

3.

4.

5.

Иммунотурбидиметрия ИФА Иммунохемилюминисценция Масс-спектрометрия 6.

7.

8.

9.

Хроматография Микроскопия с использованием моноклональных антител (иммуногистохимия) Флюоресцентная микроскопия с использованием моноклональных антител Микроплашечная и гелевая технологии в иммуногематологии 10.

Проточная цитометрия

Физический или химический принцип технологии, т.е. на чем основана технология, ее аналитические возможности и недостатки

Аналитическая чувствительность метода – способность метода выявлять минимальное количество аналита в материале

Эволюция иммуноферментных тест-систем на HBsAg

ИФА тест-системы Время появления т/с Чувствительность выявления HBsAg

Т/с 1-го поколения Т/с 2-го поколения Т/с 3-го поколения

Конец 80-х ХХ в.

2-я половина 90-х ХХ в.

2007 г.

1,0 МЕ/мл(нг/мл) 0,1 МЕ/мл 0,01 МЕ/мл

Чувствительность метода при использовании меток различных типов Тип метки обнаружения Пример метки Пределы Ферменты Бета-галактозидаза Пероксидаза хрена Щелочная фосфатаза Биолюминесценция Ферментное усиление Люцифераза светлячков 1.5x10

3x10 5x10 10 -19 10 -19 -16 -17 -16 моль моль моль моль моль Флуоресценция Ферменты/ Ион европия (III) Флуоресцеин 2x10 -17 10 -13 моль моль Пероксидаза/люминол/усилитель <10 -15 моль Хемилюминесценция Глюкозо-6-фосфат dehydrogenase péroxidase/ изолюминол * Диоксиэтаны 10 -18 моль 10 -21 моль

Метаболомика

Риск развития атеросклероза и ИБС

• • • •

Оптимальный холестерин-липопротеиновый профиль: общий холестерин – менее 5,17 ммоль/л (200 мг/дл); ЛПВП-холестерин – более 1,3 ммоль/л (50 мг/дл); ЛПНП-холестерин – менее 3,4 ммоль/л (130 мг/дл); триглицериды – менее 1,7 ммоль/л (150 мг/дл) Гомоцистеин

–

продукт обмена аминокислот, фактор, определяющий риск развития раннего атеросклероза и тромбоза

Витамин Д

(ненасыщенный циклический спирт с 4 двойными связями и боковой цепью эргостерина, одно кольцо в молекуле циклопентанпергидрофенантрена разорвано),

в отличие от других витаминов, превращается в гормон, что делает его намного более биологически активным

Локализация рецепторов к витамину Д Система/Орган/Клетка Кишечник Остебласты Остеокласты Кожа Репродуктивная система Иммунная система Ренин-ангиотензин ная система Мозг Функции Абсорбция кальция Костеобразование и минерализация Костная резорбция Дифференцировка кераноцитов. Рост и восстановление волос Овариальная/тестику лярная Иммунологический контроль Контроль объема крови Ментальная функция Патология Мальабсорбция кальция ОП, остеомаляция, остеодистрофия Аллопеция Бесплодие Аутоиммун. забо левания, опухоли Гипертензия Болезнь Альцгейм.

В продуктах питания содержание витамина D несущественно Синтез витамина D в коже

Количество месяцев, когда УФ-В лучи солнечного света не приводят к образованию в коже витамина D 3

Без вит D >6 мес/год Без вит D 1-6 мес/год Вит D круглый год Вит D круглый год Без вит D 1-6 мес/год Без вит D >6 мес/год Теоретический цвет кожи

Статус витамина D у приматов и ранних людей

160 120 80 40 0

Обезьяны Старого Света Зима 43 o

A

Сев.

широты Люди, вся поверхность кожи которых подвергается воздействию УФ-В

“Норма”

Содержание в крови при приеме 1000 МЕ/день

Источники: Cosman, Osteoporosis Int 2000; Fuleihan NEJM 1999; Scharla Osteoporosis Int 1998; Vieth AJCN 1999, 2000

80

Жители северных широт, принимающие 4000 МЕ/день Физиологическое потребление взрослыми

Клинические лаборатории США Тесты, выполнение которых возросло в наибольшей степени за последние 10 лет Тесты, с наибольшей клинической значимостью за последние 10 лет

Геномика и транскриптомика

• • • •

Молекуляно-генетические маркеры рака легких: Circulating Tumor DNA DNA Methylation —B4GALT1, KIF1A, MCAM, RarB, PAK3, SSBP2, TIMP-3 Messenger RNA —CK7, EGFR, RUNX3, SCCA, SFTPB, TGFBR3, TRGC2, TRBV9 MicroRNA —miR-15b, -21, -27b, -126, -210, -486 5p, -574-5p, -1254, -let-7d, has-miR-328, has-miR 26a, has-miR-383, has-miR-92a, msa-miR-662

Орган Почки Биомаркеры для мониторинга трансплантации Проба Биомаркер Применение Диагностика Прогноз Urine Perforin mRNA X X GB mRNA X X

Brandhorst G, Oellerich M. Individually tailored immunosuppres sion: Is there a role for biomarkers? Clin Chem 2011; 57:376 – 81.

CD103 mRNA PI-9 Granulysin mRNA IP-10 mRNA CSCR3 mRNA FOXP3 mRNA FasL mRNA Urine IP-10 Protein TIM-3 mRNA IFN γ mRNA X X X X X X X X X X X X

Почки Печень Кровь GB, perforin, FasL mRNA CD40L mRNA IL-4, -5, -6, IFN γ HLA-DRA mRNA TNF α mRNA IL-8 mRNA Сыворотка AT1R-AA Кровь TLR C3 gene Легкие Кровь CXCR, CSCL-10, CSCL9 TLR C3 gene CXCR, CSCL-10, CSCL9 X X X X X X X X X X X X X X X X X X

5 составляющих в понимании возможностей современных технологий клинической лабораторной диагностики: 1.

2.

3.

4.

5.

На чем основана технология Значение технологии для клинической практики Что отражают показатели, полученные с помощью современных технологий Аналитические возможности технологии и ее недостатки Оптимальное сочетание возможностей различных технологий для повышения их клинической эффективности

Выводы:

1.

Руководители здравоохранения, клиницисты, специалисты лабораторной диагностики должны понимать, что нам нужно как можно быстрее внедрять и осваивать новые технологии, чтобы окончательно не отстать от уровня развития медицины и лабораторной диагностики развитых стран и, соответственно, качества оказания медицинской помощи населению страны.

2.

3.

Следующим шагом является переход с уровня протеомно-метаболической диагностики, который мы пытаемся внедрить в клиническую практику, на генетический уровень диагностики. Генетический уровень требует внедрения в клиническую практику генетических маркеров диагностики сердечно-сосудис тых, онкологических, эндокринологических и других заболеваний, генетических маркеров подбора и отторжения трансплан тантов, маркеров особенностей фармакоге номики лекарственных препаратов в организме больного, генетических маркеров прогноза и исхода заболеваний и т.д.

4.

Внедрение генетических маркеров заболеваний в клиническую практику приводит к коренному изменению подходов к профилактике и лечению, и главное, достижению лучших результатов профилактики и лечения.

Что делать?

Лучшей альтернативой является сохранение спокойствия?

Что делать?

Практически осуществлять переход от кустарных лабораторных мастерских к автоматизированной конвейерной индустрии и внедрять современные технологии в клиническую практику

Смело верь тому, что вечно, Безначально, бесконечно, Что прошло и что настанет, Обмануло иль обманет Все на свете редко стало ─ Есть надежды ─ счастья мало; Не забвение разлука: То ─ блаженство, это ─ мука.

М.Ю. Лермонтов