Transcript Power-Point-Präsentation

Analyitsche Auswertung von
Molecular Imprinted Polymeres per
Gel-Elektrophorese
Henrik Scholz & Benjamin Wanitschka
Übersicht
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Grundlagen der Elektrophorese
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Gel-Elektrophorese
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Herstellung MIPs
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Messung eines MIPs und eines NIPs
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Auswertung mit dem Densitometer
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Grund für diese Analyse-Methode
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Fragen?!?!
Grundlagen der Elektrophorese
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unter Elektrophorese versteht man das
wandern von gelösten ionischen Verbindungen
in einem elektrischen Feld
sie findet oft ihren Einsatz um Aminosäuren,
Proteine, Nucleinsäuren oder Lipine zu
analysieren
Es gibt sowohl eine Elektrophorese die man in
freier Lsg. durchführt als auch die sog. TrägerElektrophorese wobei die 2. im Laboraltag
überwiegt
Gel-Elektrophorese
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Als Trägergel benutzt man hauptsächlich
Polyacrylamid, es wirkt als eine Art
Molekularsieb
→ d. h. sie werden im elektrischen Feld
proportional zu Ihrer Molekularmasse
langsamer oder schneller wandern
Soll das Protein oder die Aminosäure nur nach
seiner Größe und nicht nach seiner Ladung
aufgetrennt werden, wird SDS zugesetzt
SDS-PAGE
Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel
elektrophoreses
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dabei werden die meisten Proteine und
Aminosäuren gebunden und erzeugen eine
hohe negative Nettoladung der Moleküle
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→ dadurch unterscheiden sie sich nur noch in
der Molekularmasse und werden dann danach
aufgetrennt
Herstellung MIPs
- funktionelle Monomere dienen als Anker für das
Templat und halten es während der folgenden
Polymerization in Position
- nach entfernen des Templats aus dem
gebildeten Polymer werden Andockstellen frei
-> diese soind komplementär zur Form und den
funktionellen Gruppen des Templats
- die molekular geprägten Polymere kurz MIPs
besitzen also ein Gedächtnis für ihr Templat und
können es oder nahe Strukturen selektiv binden
ähnlich den menschlichen Antikörpern
Herstellung MIPs
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Präparieren der SDS Gels:
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1. Separtion gel
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Wasser
Separation Buffer
MBA Lsg. 30% 1 eq.
SDS
APS
TMEDA
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Präparieren der SDS Gels:
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2. Stacking gel
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Wasser
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Separation Buffer
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MBA Lsg. 30% ca. 0.1 eq.
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SDS
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APS
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TMEDA
Messung eines MIP´s und eines NIP´s
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Probenvorbereitung
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10 µg des NIP´s und des MIP´s
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7 ml Puffer (pH 6,8)
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2 ml Glycerin
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0.4 ml SDS
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500 µL β-mercaptoethanol
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Bromophenolblue um es kenntlich zu machen
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Running Buffer
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75,5 g Tris
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470 g Glycerin
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4 L Wasser
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250 ml 10% SDS
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Vorbereitung der Gels:
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Messung eines MIPs und eines NIPs
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Zunächst die Separation-Gel Lsg. Zwischen
die beiden Glasplatten geben, polymerisieren
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Dann die Stocking-Gel Lsg darauf geben und
den „Kamm“ in der Halterung fest machen
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Kammer für 2 Gels
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Nach Ende der Polymerisation kann der
„Kamm“ entfernt werden und man kann nun
den „Marker“, das NIP und das MIP auf das
Gel aufgeben!
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Der Marker dient als Vergleich da er eine genau
festgelegte Auftrennung hat, die man im
Densitometer mit den beiden Proben
vergleichen kann
Messung eines MIP´s und eines NIP´s
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Das auftragen der Proben erfolgt mit einer
Eppendorf-Pipette
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Anschließend gibt man die Gelplatten in das
Elektophorese-Gerät das mit der RunningSolution befüllt wurde
Messung eines MIPs und eines NIPs
Messung eines MIPs und eines NIPs
Messung eines MIPs und eines NIPs
Messung eines MIPs und eines NIPs
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Nachdem man die Gels in das Gerät gestellt
hat, stellt man es an und gibt die
entsprechenden Parameter ein
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Bei 50-60 mA ca. 30 Min.
Auswertung mit dem Densitometer
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Nach der Gel-Elektrophorese wird das Gel mit
einem Anfärbereagenz anfärbt und über Nacht
stehen gelassen. Am nächsten Tag mit viel
Wasser mehrmals gewaschen um die Proteine
oder Aminosäuren sichtbar zu machen!
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Würde man die Gels nicht mit viel Wasser
waschen dann hätte man ein komplett blaues
oder rotes Gel und man könnte nichts erkennen
und keine Auswertung vornehmen
Messung eines MIPs und eines NIPs
Auswertung mit dem Densitometer
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Anfärbereagenz:
Auswertung mit dem Densitometer
Auswertung mit dem Densitometer
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Man legt nun das Gel auf eine spezielle
Glasplatte im Densitometer
Auswertung mit dem Densitometer
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Das Densitometer misst die Absorption des
Gels und daraus kann man die Menge an
Substanz errechnen
Grund für diese Analyse-Methode
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Der Grund für diese Methode ist, dass man
überprüft ob die Polymere die man hergestellt
hat so funktionieren oder wie gut sie
funktionieren wie sie es sollen
NIP´s (Nonimprinted Polymeres)
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Es ist das Polymer ohne Zusätze
MIP´s (Molecular Imprinted Polymeres)
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Es bedeutet dass dieses Polymer ein Protein
beinhaltet
Grund für diese Analyse-Methode
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Wenn man nun die beiden gegeneinander auf
dem Gel auftragt dann kann man genau
vergleichen ob und wie gut das Polymer das
man Synthetisiert hat funktioniert
Fragen?!?!
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!