11. VAJA:

METODE ZA IZOLACIJO IN LOČEVANJE PROTEINOV

  

HOMOGENIZACIJA:

Proces, s katerim razbijemo celične stene in celične membrane (celični organeli ostanejo intaktni).

Rezultat je homogenat ali tkivna kaša .

Ločiti od: DEZINTEGRACIJA celičnih struktur, vključno z organeli; DISPERZIJA – popolno razbitje vseh – ločitev tkiva na bolj ali manj intaktne celice.

   Uspešni, če je: izkoristek čim večji, kontaminacija z neželjenimi snovmi čim manjša, struktura iskane snovi nespremenjena.



HOMOGENIZACIJA:

Fizikalne tehnike homogenizacije:     v terilnici (dodatek steklenih kroglic) ; kremenčevega peska, s spremembo pritiska (francoska preša) ; zamrzovanjem ; osmotskim šokom ; z z ultrazvokom ; z mešalci (warring blendor, Elvejham-Potterjev homogenizator) .

    Kemični način : avtoliza; različni encimi (lizocim, celulaze, pektinaze, fosfolipaze); detergenti.

      

OPTIMALNI POGOJI:

  čim krajši čas izolacije; delamo pri nizkih temperaturah; pazimo na ionsko sestavo (izotoničnost): dodatek elektrolitov (NaCl, KCl) dodatek sladkorjev (saharoza, manitol, sorbitol);    pazimo na ustrezen pH (pufri); dodatek oksidantov/reducentov; izboljšamo topnost encime (glicerol, etilenglikol, detergenti); inaktiviramo: odstranimo dvovalentne katione (Ca 2+ , Mg 2+ , Cu 2+ ) z dodatkom kompleksalov (EDTA, citronska kislina), z dodatkom inhibitorjev, denaturiramo s povišanjem T.

RAZTAPLJANJE IN OBARJANJE: Frakcionirano obarjanje: sprememba topnosti.

Razrede beljakovin obarjamo tako, da povečujemo količino obarjalnega sredstva. Oborjene beljakovine odstranimo s CENTRIFUGIRANJEM.

Vpliv na topnost beljakovin:   ionska jakost elektrolitov, pH,   dielektrična konstanta, temperatura.

CENTRIFUGIRANJE:

metoda, ki temelji na različnem usedanju delcev v polju centrifugalne sile.

 radialnega pospeška

t s

a r = ω 2 r ( ω -kotna hitrost, r - polmer rotorja);  gostote (  d ) in velikosti (polmer r d ) delca;  gostote (  m ) in viskoznosti ( η ) medija.

Čas sedimentacije sferičnih delcev izračunamo:  9 2   2 

r d

2   

d

 

m

  ln

r r

1 2 r 1 - radialna razdalja od osi do položaja delca ob t s = 0 r 2 - radialna razdalja od osi do položaja delca ob t s

CENTRIFUGIRANJE

:

1. Preparativno centrifugiranje:  diferencialno centrifugiranje ,  gradientno centrifugiranje .

2. Analitsko centrifugiranje sediment  supernatant

DIALIZA IN ULTRAFILTRACIJA:

1. Dializa: raztopini ločimo s polprepustno membrano dializni dializat preostanek 2. Ultrafiltracija: nadtlak potisnega plina ali centrifugalna sila ultrafiltrat filtrirni preostanek (retentat)

ELEKTROMAGNETNI SPEKTER

ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA:

Absorpcija svetlobe vzbujeno stanje: M + h = M *

Absorpcija UV (180–340 nm) ali vidne svetlobe (340–800 nm)

T



I I o A

  log 10

T



Beerov - Lambert

-ov

zakon:

A = ε∙l∙c

SPEKTROFOTOMETER

UPORABA:

merjenje koncentracije snovi, kvalitativna analiza snovi, zasledovanje kemijskih reakcij, raziskave strukture DNA, študije lastnosti proteinov in vezave majhnih molekul nanje.

IZOLACIJA BELJAKOVIN Z OBARJANJEM

Izolacija Ig iz seruma (goveji, konjski, svinjski, ovčji): 4 mL seruma + 2 mL nasičene razt. amonsulfata (NAS) (= 33 % nasičenje z (NH 4 ) 2 SO 4 )) Obarjanje Ig 30 min na ledu z občasnim mešanjem Centrifugiranje 15 min na 3000 g, 4 o C (ločevanje oborine od supernatanta)

Supernatant

(serumske beljak. brez protiteles)

Oborina (sediment)

(protitelesa – Ig) raztopimo v 1,5 mL PBS (pH 7,2)

KVANTITATIVNO DOKAZOVANJE BELJAKOVIN

Vzorci za kvantitativno določanje beljakovin: Slepa proba (2×) Serum Protitelesa, izolirana iz seruma z obarjanjem (33% NAS)

MERJENJE ABSORPCIJE PRI 280 nm:

1. Vzorcu ( redčen 1:100!

) izmeri absorpcijo pri 280 nm 2. Predpostavi, da je oz.

ε = 1 mL/mg  cm ε = 1,4 mL/mg  cm za za serum , protitelesa in IZRAČUNAJ koncentracijo proteinov v vzorcu (l = 1 cm) po Beer – Lambert -ovem zakonu!

BIURETSKA REAKCIJA:

1.

Naredi

umeritveno krivuljo

proteinskih raztopin: s standardnimi koncentracijami γ (mg/mL) 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 2. Vzorec (serum ali Ig) redčen 1:10 3. Slepa proba : 2 mL PBS pufra + 3 mL biuretskega reagenta

 Standardne proteinske raztopine za biuretsko reakcijo : (osnovna raztopina BSA: γ = 10 mg/mL ) - x mL PBS pufra - x mL raztopine BSA 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 mg/mL 1. K 2 mL vzorca dodaj 3 mL biuretskega reagenta.

2. Inkubiraj 10 minut pri 37°C.

3. Izmeri absorpcijo pri

540 nm

in nariši umeritveno krivuljo!

BIURETSKA REAKCIJA:

1,0 mg/mL 2,0 mg/mL 4,0 mg/mL 6,0 mg/mL 8,0 mg/mL 10,0 mg/mL Vzorec seruma Vzorec Ig A 540 γ = γ =

DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z Bio-Radovim reagentom:

1.

Naredi

umeritveno krivuljo

proteinskih raztopin: s standardnimi koncentracijami γ (mg/mL) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2. Vzorec (serum ali Ig) redčen 1:100 3. Slepa proba : 100 μL PBS pufra + 5 mL Bio-Radovega reagenta

 Standardne proteinske raztopine za (osnovna raztopina BSA: c = 1 mg/mL Bio-Rad reakcijo ) : - x mL PBS pufra - x mL raztopine BSA 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 mg/mL 1. K 100  L vzorca dodaj 5 mL Bio-Radovega reagenta (redčenega 1 + 4).

2. Inkubiraj 10 minut na RT.

3. Izmeri absorpcijo pri

595 nm

in nariši umeritveno krivuljo!

BIO-RADOV REAGENT:

0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,4 mg/mL 0,6 mg/mL 0,8 mg/mL 1,0 mg/mL Vzorec seruma Vzorec Ig A 595 γ = γ =