VỚI HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ TỎI (Allium sativum)
Download
Report
Transcript VỚI HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ TỎI (Allium sativum)
THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH NHIỄM KHUẨN
DO Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) VỚI HỢP CHẤT
CHIẾT XUẤT TỪ TỎI (Allium sativum)
Lý Thị Thanh Loan và ctv, 2007 (Trích báo cáo Tổng kết đề tài cấp Bộ : Thử nghiệm
sử dụng một số cây thuốc và hợp chất chiết xuất từ thảo mộc trong phòng và trị các bệnh
truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng ở tôm, cá - Viện NCNT TS II : cơ quan chủ trì đề tài)
I. Mở Đầu
Cá tra và cá basa đang là thế mạnh xuất khẩu của Việt Nam,
hiện nay đối tượng nuôi này đang gặp phải trở ngại vì một số
bệnh có thể gây chết hàng lọat như bệnh do môi trường, vi
khuẩn, virus (?) hoặc ký sinh trùng, nấm gây ra .
Nhóm vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết trên cá tra chủ yếu
thuộc giống Aeromonas trong đó A. hydrophila là tác nhân
chủ yếu gây bệnh xuất huyết, phù đầu và có độc lực mạnh
nhất.
Việt Nam cũng là một trong những nước có tiềm năng to lớn
về cây thuốc, với hơn 3920 loại thực vật được dùng làm thuốc;
trong đó một trong những loài được nghiên cứu và ứng dụng
nhiều là Tỏi (Allium sativum).
II. Mục tiêu
Nhằm hạn chế tác hại do các tác nhân gây bệnh
cũng như các loại kháng sinh gây ra, một số hợp
chất chiết xuất từ thảo mộc và hợp chất chiết xuất
từ tỏi (Allium sativum) được sàng lọc và thử
nghiệm trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn do
Aeromonas hydrophila trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)
III. Noäi dung nghieân cöùu
Sàng lọc các hợp chất chiết suất từ thảo mộc trên
chủng Aeromonas hydrophila
Xác định nồng độ tối thiểu gây ức chế (MIC)
Aeromonas hydrophila của hợp chất chiết xuất từ
Tỏi (Allium sativum)
Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) trong phòng thí nghiệm
Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) ngoài ao nuôi
Nguyên vật liệu và phương Pháp Nghiên Cứu
Nguyên vật liệu
Cao tỏi (do PTN Dược lý – TTQT cung cấp).
Sản phẩm từ cao tỏi.
Một số hóa chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn (RS,
MHA, BA, …)
Phương Pháp Nghiên Cứu
Phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ (Bauer –
kirby, 1997 )
Phương pháp tìm nồng độ ức chế tối thiểu – MIC
(Washington, 1985); Samuelsen and Lunestad, 1996)
Bố trí thí nghiệm điều trị: Wetlab và ao nuôi thương
phẩm.
Mẫu bệnh
phẩm
Gây cảm nhiễm để xác
định vi khuẩn gây bệnh
Bố trí thử nghiệm xác định
liều hiệu quả trong Wet-lab
Phân lập tác nhân gây beänh
Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược
có tác dụng kháng lại vi khuẩn phân lập
được
Thử nghiệm ngoài ao nuôi
Quy trình phòng trị
Sơ đồ 1. Quy trình thử nghiệm các chất hiệu quả phòng trị bệnh tôm, cá
Cá tra thí nghiệm, chủng vi khuẩn A. hydrophila
Nuôi thuần trước cảm nhiễm
Lô đối chứng âm 1
Lô đối chứng âm
2
Lô đối chứng
dương
Lô điều trị (50, 100
mg/Kg cá)
Quan sát biểu hiện của cá sau cảm nhiễm
Không điều trị (thức
ăn không trộn thuốc)
Không điều trị
(thức ăn không trộn
thuốc)
Điều trị
(thức ăn có trộn thuốc)
Thu mẫu, xác định tỷ lệ nhiễm bệnh (kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn A.
hydrophila trong mẫu máu, nước, tỷ lệ chết và xác định liều điều trị hiểu quả.
Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm điều trị
RPS (Relative percent survival)
tyûleä(%) caù
cheát
nhoùm
thöûthuoác
*100
1 tyû
leä
(%)
caù
cheát
nhoùm
ÑC
döông
Hợp chất có hiệu quả điều trị : RPS > 60%
KẾT QUẢ
Cá tra bị xuất huyết, phù đầu do
nhiễm Aeromonas hydrophila
4.1. Kết quả sàng lọc các hợp chất chiết suất từ thảo mộc trên
chủng Aeromonas hydrophila
Bảng 1. Kết quả sàng lọc hiệu quả kháng khuẩn của một vài thảo dược (sau
24 giờ) với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
n
STT
Họ cây
Ký
hiệu
Kết quả sàng lọc ở các nồng độ khác nhau
300
mg/ml
400
mg/ml
500
mg/ml
600
mg/ml
700
mg/ml
1
Họ Hành Alliaceae
LA
10
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
2
Họ Tỏi Liliaceae
T
10
(-)
(+)
(+ +)
(+ +)
(+ +)
3
Họ Tiêu Piperaceae
27
10
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
4
Họ Myrtaceae
P
10
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
5
Họ Chè Theaceae
X
10
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Nước cất vô trùng
ĐC
10
6
(-)
Cao tỏi
Hình 2. Tỏi (Allium sativum) dùng chiết xuất cao tỏi
IV. Kết Quả và Thảo Luận
4.1. Kết quả sàng lọc các hợp chất chiết suất từ thảo mộc
trên chủng Aeromonas hydrophila
Hoï Sim Myrtaceae (noàng ñoä 500 mg/ml)
Hoï Tieâu Piperaceae (noàng ñoä 500 mg/ml)
Hoï Cheø Theaceae (noàng ñoä 500mg/ml)
Hoï Toûi Liliaceae (noàng ñoä 500 mg/ml)
Hoï Haønh Alliaceae (noàng ñoä 500 mg/ml)
Hình 1. Hiệu quả kháng khuẩn của các thảo dược (sau 24 giờ)
với Aeromonas hydrophila
4.1. Kết quả sàng lọc các hợp chất chiết suất từ
thảo mộc trên chủng Aeromonas hydrophila
Hợp chất: họ Hành (Alliaceae), họ Tiêu (Piperaceae),
họ Sim (Myrtaceae), họ Chè (Theaceae) không có tác
dụng đối với Aeromonas hydrophila
Hợp chất chiết xuất từ Tỏi là hợp chất tạo được vòng
vô khuẩn với đường kính trên 12 mm; do đó hợp chất
chiết xuất từ Tỏi được ghi nhận có tác dụng kháng
khuẩn tốt nhất với chủng vi khuẩn Aeromonas
hydrophila ở các nồng độ 500, 600, 700 mg/ml.
4.2. Kết quả xác định nồng độ tối thiểu gây ức chế
(MIC) Aeromonas hydrophila của hợp chất chiết
xuất từ Tỏi (Allium sativum)
Cao tỏi
Hình 2. Tỏi (Allium sativum) dùng chiết xuất cao tỏi
Bảng 2. Kết quả khảo sát MIC của hợp chất T (Allium sativum L.họ
Liliaceae) trên môi trường MHA với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Nồng độ
hợp chất
T(mg/ml)
n
(số
lần
lập
lại)
1
20,0
2
STT
Thời gian khảo sát
18 giờ
24 giờ
36 giờ
Mức độ
mọc
của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
Mức độ
mọc
của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
Mức độ
mọc
của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
20
+++
100
+++
100
+++
100
20,5
20
+++
100
+++
100
+++
100
3
21,0
20
+++
100
+++
100
+++
100
4
21,5
20
+++
100
+++
100
+++
100
5
22,0
20
+++
100
+++
100
+++
100
6
22,5
20
+++
100
+++
100
+++
100
7
23.0
20
+++
100
+++
100
+++
100
8
23,5
20
+++
100
+++
100
+++
100
9
24,0
20
++
100
+++
100
+++
100
10
24,5
20
++
100
++
100
+++
100
Nồng độ
hợp chất
T(mg/ml)
n
(số
lần
lập
lại)
11
25,0
12
STT
Thời gian khảo sát
18 giờ
24 giờ
36 giờ
Mức độ
mọc
của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
Mức độ
mọc
của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
Mức độ
mọc của
khuẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa có
khuẩn lạc
mọc
20
++
100
++
100
++
100
25,5
20
++
100
++
100
++
100
13
26,0
20
++
100
++
100
++
100
14
26,5
20
+
100
++
100
++
100
15
27,0
20
+
100
++
100
++
100
16
27,5
20
+
95
+
100
++
100
17
28,0
20
+
95
+
95
+
100
18
28,5
20
+
85
+
90
+
95
19
29,0
20
+
80
+
80
+
85
Bảng 2. Kết quả MIC của hợp chất T (Allium sativum L.họ Liliaceae) trên
môi trường MHA với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Nồng độ
hợp
chất
T(mg
/ml)
n
(số lần
lập
lại
)
19
29,0
20
STT
Thời gian khảo sát
18 giờ
24 giờ
36 giờ
Mức độ
mọc
của
khu
ẩn
lạc
Tỷ lệ (%)
số đĩa
có
khuẩn
lạc
mọc
Mức độ
mọc
của
khu
ẩn
lạc
Tỷ lệ (%) số
đĩa có
khuẩn
lạc mọc
Mức độ
mọc
của
khu
ẩn
lạc
Tỷ lệ (%) số
đĩa có
khuẩn
lạc mọc
20
+
80
+
80
+
85
29,5
20
+
65
+
70
+
75
21
30,0
20
-
30
-
35
-
40
22
30,5
20
-
15
-
15
-
20
23
31,0
20
-
0
-
0
-
0
24
31,5
20
-
0
0
0
0
0
25
32,0
20
-
0
0
0
0
0
26
32,5
20
-
0
0
0
0
0
27
33,0
20
-
0
0
0
0
0
28
33,5
20
-
0
0
0
0
0
29
34,0
20
-
0
0
0
0
0
30
34,5
20
-
0
0
0
0
0
31
35,0
20
-
0
0
0
0
0
4.2. Kết quả xác định nồng độ tối thiểu gây ức
chế (MIC) Aeromonas hydrophila của hợp chất
chiết xuất từ Tỏi (Allium sativum)
Nồng độ nhỏ hơn 29,5 mg/ml hầu như không
có khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophila (vi
khuẩn vẫn phát triển giống như cấy trên đĩa đối
chứng – không dùng hợp chất chiết xuất từ tỏi)
Nồng độ chất chiết xuất đạt 31 mg/ml thì vi
khuẩn hoàn toàn không mọc với tỷ lệ 100%
(trong 36 giờ thí nghiệm).
4.3. Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) trong phòng thí nghiệm
Bảng 3. Kết quả trước và sau khi sử dụng hợp chất T (Allium sativum) điều trị
bệnh nhiễm khuẩn do A. hydrophila trên cá tra (P. hypophthalmus)
Trước khi sử
dụng thuốc
Lô thí
nghiệm
Sau khi sử dụng thuốc
Sau 3 ngày cảm
nhiễm
4 ngày (1)
7 ngày (2)
10 ngày (3)
A.
Tỷ lệ
chết
(%)
A.
Tỷ lệ
chết
(%)
A.
Tỷ lệ
chết (%)
A.
Tỷ lệ
chết
(%)
Tỷ lệ sống
RPS(%)
ĐC âm
-
0
-
0
-
3,33
-
6,67
-
ĐC dương
+
0
+
43,33
+
73,33
+
86,67
-
Lô điều trị
thuốc
50 mg/kg
+
3,33
+
23,33
+
40
-
40,00
53,84
Lô điều trị
thuốc
100 mg/kg
+
0
+
16,67
+
26,67
-
26,67
69,23
4.3. Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) trong phòng thí nghiệm
Khi cá xuất hiện dấu hiệu bệnh lý, cá ở các lô thử
nghiệm bắt đầu cho ăn thức ăn có trộn hợp chất chiết
xuất từ tỏi (Allium sativum) với liều 50 mg và 100 mg/kg
thể trọng/ngày, chia làm 2 lần/ngày. Kết quả chữa trị sau
khi gây nhiễm được trình bày trong Bảng 3.
Ở hai lô thử nghiệm dùng hợp chất chiết xuất tỏi
(Allium sativum) điều trị thì tỷ lệ cá chết giảm dần trong
7 ngày và từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 10 điều trị thì cá
không còn chết.
Thu mẫu máu cá kiểm tra sự hiện diện của A.
hydrophila thì chỉ có lô đối chứng dương vẫn có sự
hiện diện của A. hydrophila. Trong khi đó, các lô còn
lại hoàn toàn không sự hiện diện vi khuẩn này.
Tỷ lệ sống (%) (Relative Percent Survival) - RPS
cũng tăng dần theo nồng độ thuốc. RPS lô điều trị
50mg là 53,84% và lô điều trị 100mg là 69,23%.
Như vậy trong điều kiện thí nghiệm thì ở nồng độ 100
mg/kg thể trọng/ngày của hợp chất chiết xuất tỏi
(Allium sativum) có hiệu quả trong việc phòng và trị
bệnh nhiễm khuẩn A. hydrophila ở cá tra.
4.4. Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) ngoài ao nuôi
Hình 3. Cá tra bị xuất huyết, phù mắt
4.4. Thử nghiệm điều trị trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) ngoài ao nuôi
Bảng 4. Kết quả đánh giá cường độ mầm bệnh hiện diện trên cá so với thời
gian dùng hợp chất T (Allium sativum)
Đợt thu
mẫu
Trọng lượng
(g/cá thể) (n=30)
26/7
29/7
Không thu mẫu
xét nghiệm
Biểu hiện bệnh tích
Mầm bệnh
Số
Xuất huyết gốc vây, hậu môn
lồi, phù mắt, xuất huyết
nội tạng, mạch máu xung
huyết
A.
800 con/ngày
hydrophyla
(83,33%)
Ed.
Ictaluri
(70%)
Xuất huyết gốc vây, đốm đỏ ở
bụng và xung quanh mắt,
hậu môn lồi, phù mắt,
xuất huyết nội tạng, mạch
máu xung huyết, có dịch
trong dạ dày
lượng cá
chết
(con/ngày)
Cách chữa trị
Thu mẫu về phòng thí
nghiệm phân tích
1000
– 1200
con/ngày
Bắt đầu dùng hợp chất
T, liều dùng
100 mg/1kg cá liên tục
trong 5 ngày
–
20
con/ngày
Tiếp tục dùng hợp chất
T liều dùng 100
mg/1kg cá liên
tục 5 ngày
03/08
Xuất huyết nhẹ gốc vây, nội
tạng xuất huyết nhẹ, dạ
dày chứa thức ăn
A.
hydrophyla
(16,66%)
Ed. ictaluri
(10%)
A. caviae (10%)
15
08/8
Cá bình thường
A. hydrophyla
(3,33%)
2- 3 con/ngày
Ngưng cho ăn hợp chất
T
4.4. Thử nghiệm điều trị bệnh nhiễm khuẩn do A. hydrophila
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ngoài ao nuôi
Kết quả ghi nhận cá bệnh có sự hiện diện hai loài vi
khuẩn A. hydrophyla (83,33%) và Ed. ictaluri (70%).
Tỷ lệ chết của cá là 800 con/ ngày đến 1.200
con/ngày. Do đó tiến hành điều trị chia thành 2 giai
đoạn:
Giai đoạn 1 cho cá ăn liên tục hợp chất chiết xuất từ
tỏi trong 5 ngày với liều dùng 100 mg/1kg cá.
Giai đoạn 2 cho cá tiếp tục dùng hợp chất chiết xuất
từ tỏi với liều dùng và thời gian tương tự giai đoạn 1
Sau khi điều trị 5 ngày tỷ lệ chết giảm rất đáng kể từ
1200 con/ ngày giảm còn 15 – 20 con/ngày; đồng thời
thu mẫu cá kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn cũng
giảm như đối với vi khuẩn A. hydrophyla và Ed.
ictaluri chỉ còn hiện diện 16,66% và 10%
Sau 10 ngày điều trị hoàn toàn không thấy xuất hiện
xuất huyết bên ngoài và trong nội tạng, cá bắt mồi tốt,
tỷ lệ các chết chỉ còn khoảng 2 – 3 con/ngày; cá được
thu mẫu sau 10 ngày điều trị chỉ còn 3,33% trên tổng
số cá kiểm tra còn sự hiện diện của A. hydrophyla,
còn Ed. ictaluri , A. caviae không còn hiện diện trong
mẫu kiểm tra.
V. KẾT LUẬN
Nồng độ tối thiểu gây ức chế (MIC) của hợp chất
chiết xuất từ tỏi (Allium sativum) đối với vi khuẩn A.
hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (P.
hypophthalmus) là 31 mg/ml.
Hợp chất chiết xuất từ tỏi (Allium sativum) có hiệu
quả trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn do A. hydrophila
với liều dùng là 100 mg/kg thể trọng cá / ngày, thời
gian điều trị 10 ngày, hiệu quả điều trị được ghi nhận
với chỉ số RPS (Relative percent survival) > 60%.