Transcript Validierung

Qualitätssicherung
in der Analytischen Chemie
• Organisationen:
• International:
ISO (www.iso.ch), ICH,
IUPAC (www.iupac.org)
• Europa:
EN (www.cenorm.be)
• Deutschland:
DIN (www.din.de)
• GB:
BS (www.bsi.org.uk)
• USA:
ASTM (www.astm.org)
Einige wichtige Informationsquellen:
• Europa
– EURACHEM - Co-operation for Analytical Chemistry in Europe
– EUROLAB - Organization for Testing in Europe
– EA - European Co-Operation for Accreditation
– EUROMET - A European Collaboration in Measurement Standards
IRMM Institute for Reference Materials and Measurements
• International
– CITAC - Co-Operation on International Traceability in Analytical
Chemistry
– NIST – (US) National Institute of Standards and Technology
Validierung
• Confirmation by examination and provision of objective
evidence that the particular requirements for a specified
intended use are (Bestätigung durch Bereitstellung eines objektiven
Nachweises, dass die Anforderungen für einen spezifischen beabsichtigten
Gebrauch oder eine spezifische beabsichtigte Anwendung erfüllt worden sind
ISO 8402 (1994))
• Fremdwörterlexikon: „Bestätigung“
• Nachweis, dass eine Methode zuverlässig innerhalb
festgelegter Grenzen zum erwarteten Ergebnis führt
• wichtige Rolle in der Qualitätskontrolle und
Qualitätssicherung
• wichtiger Bestandteil der GMP, GLP
• wichtiges Element zur Gewährleistung der
Arzneimittelsicherheit
Was ist Methodenvalidierung?
• Der formelle und dokumentierte Prozess des Nachweises, dass eine
Methode zur Lösung des speziellen analytischen Problems geeignet ist.
• Prozess der Etablierung der Eigenschaften und Grenzen einer Methode
und die Identifizierung der Einflüsse, die diese Eigenschaften ändern
können sowie das Ausmass der Änderungen der Eigenschaften.
• Welche Analyten können durch die Methode in welchen Matrices in
Anwesenheit welcher Störungen bestimmt werden?
• Welche Genauigkeit und welche Präzision können unter diesen
Umständen erreicht werden?
• Methodenvalidierung umfasst nicht nur den Prozess der Ermittlung
der Methodenparameter.
Wann sollte eine Methode validiert werden?
•
•
•
•
Vergleich von Methoden
Ersatz von Instrumenten
Wechsel des Personals
Andere signifikante Änderungen
Dokumentation der Validierung
• Wichtiger Teil der Laborqualität
• Standardleitfaden für Dokumentation zu finden unter der
Serie ISO 78
• Kann auch in einer laborinternen Version abgefasst werden
• Sollte am Ende kontrolliert werden
•Warnungen, Sicherheitshinweise
• komplett
•Materialien, Chemikalien
• Autorisiert zur Nutzung
•Ausrüstung
• Version
•Probennahme,
• Datum
Probenvorbereitung
• Autor
•Berechnungen
• copyrights
•Kalibrierung
• Letztes update
•Referenzen….
Chemische Messungen
Probennahmestrategie
Problem
Probennahme
Charakterisierung
Probe
Messung
Vorbereitung
Messprobe
Messung
Messwert
Chemische
Information
Datenanalyse
Untersuchungsobjekt
Verjüngung
Stichprobe
Interpretation
Auswertung
Analysenergebnis
Messprobe
xi (Ai)
Messung
Messergebnis
Auswertung
chemischer
Signalfunktion
Eigenschaften
Ai
xi
zi
yi
latente
Codierung der
Informationen Probenüber n Analyte information
Ai (i=1,…..,n)
und deren
Mengen xi
yi (zi)
Intensitäten
yi in
charakterist.
Positionen zi
zi
yi
Ai
xi
Analysenergebnis
xˆ i (A i )
Chemometrische
Auswertung
xi, Ai
Decodierung Informationen Klassen,
der Signal- über n Analyte Faktoren,
information Ai und deren Korrelationen,
Menge xi
Modelle
Chemische
Information
Problemlösung
Qualität,
Herkunft,
Ursachen,
Ausbeuten
usw.
Wie sollte eine Methode validiert werden?
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Bestimmung von Identität, Selektivität und Spezitivität
Nachweisgrenze (Limit of detection)
Bestimmungsgrenze (Limit of quantitation)
Arbeitsbereich, Bereich der Linearität (Working and
linear ranges)
Genauigkeit (accuracy)
Richtigkeit (trueness)
Präzision (precision)
Wiederholbarkeit (repeatability)
Reproduzierbarkeit (reproducibility)
Sensitivität (sensitivity)
Robustheit (robustness)
Wiederfindungsrate (recovery)
Werkzeuge für die Validierung
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Blindproben
Proben mit Standardadditionen
Angereicherte Materialien/Proben (spiked materials)
Material charakterisiert von anderen Laboren
Standardlösungen
Referenzmaterialien
Zertifizierte Referenzmaterialien
Statistische Datenauswertung-Chemometrie
Wiederholungsmessungen
Referenzmaterialien
-Materialien oder Substanzen, bei denen die Werte einer oder
mehrerer Eigenschaften ausreichend homogen verteilt und gut
bekannt sind und damit zur Kalibrierung von Apparaten oder
zur Bewertung einer Messmethode verwendet werden
können
-können in Form von Gasen, Flüssigkeiten oder Feststoffen
vorliegen
Beispiel:
Wasserproben für die Kalibrierung von Viskosimetern
-zertifizierte Referenzmaterialien (CRM)
besitzen ein Zertifikat, dass ein oder mehrere Eigenschaften
durch eine etablierte Methode garantiert werden können (mit
Angabe der statistischen Unsicherheit)
Beispiel:
Pufferlösungen
Reference Materials in Analytical Chemistry - A Guide for Selection and
Use, edited by A Zschunke, Springer, 2000
Identität-Selektivität-Spezifität
• Identität: Signal kann dem Analyten zugeordnet werden
• Selektivität: Verschiedene, nebeneinander zu bestimmende
Komponenten können ohne gegenseitige Störung erfasst werden
• Spezifität: akkurate Bestimmung des interessierenden Analyten in
Anwesenheit anderer Komponenten in der Probenmatrix unter den
gegebenen Testbedingungen
Grundlagen der Statistik
• Analytische Ergebnisse variieren
immer
-Abweichungen während der Messung
-Inhomogenitäten zwischen den Stichproben
einer Gesamtprobenmenge
• Treten scheinbar keine Abweichungen
auf, ist die Auflösung der Methode
nicht hoch genug.
322
322
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322
322,3
322,5
322,3
322,2
321,7
321,8
321,7
322,2
321,6
322,4
322,4
321,5
322,4
322,1
322,2
322,5
321,7
321,8
321,9
322,4
322,29
322,49
322,28
322,17
321,67
321,76
321,75
322,17
321,58
322,36
322,40
321,53
322,42
322,05
322,16
322,47
321,73
321,76
321,85
322,41
Histogramm
Zur Beschreibung der Variabilität einer Messgröße
Einteilung der Messungen in Gruppen
Zählen der Beobachtungen pro Gruppe
Balkendiagramm zur Darstellung der Häufigkeit
20
18
frequency
•
•
•
•
16
14
12
10
8
6
4
2
0
45,75 46,25 46,75 47,25 47,75 48,25 48,75 49,25 49,75 50,25 50,75
mg/g
Verteilung
frequency
• Wenn die Anzahl der Messwerte steigt und die Gruppen
kleiner werden, kommt man zu einer Verteilungskurve
x
Die Normalverteilung
• Carl Friedrich Gauss, 18.
Jahrhundert
• glockenförmig, bestimmt durch
µ und σ
• symmetrisch bezüglich µ
– je größer σ, je breiter die
Kurve
– ca. 68% (68,27%) der Daten
liegen im Bereich µ±1σ
– ca. 95 % (95,45%) der Daten
liegen im Bereich µ±2σ
– ca. 99,7 % (99,73%) der Daten
liegen im Bereich µ±3σ
1
y
e
 2
( x  ) 2
2 2
Beschreibung einer Verteilung
-
n
Lage
arithmetisches Mittel:
x
x
i
i 1
n
Median: Sortierung der Werte nach ihrer Größe, Median ist der
zentrale Wert
Probe
Population
-
n
n
Streuung, Varianz
2 
 (x
i 1
i
 )
2
s2 
n
-
Standardabweichung
-
Relative Standardabweichung
-
Symmetrie
 
i 1
i 1
i
 x) 2
n1
n
n
 (x
 (x
i
 )
n
s
RSD 
x
2
s
 (x
i 1
i
 x) 2
n 1
Zufällige Fehler:
-bestimmt durch die begrenzte Präzision einer Messmethode,
-können durch eine große Anzahl von Wiederholungsmessungen
minimiert werden
Systematischer Fehler (bias):
-konstanter order multiplikativer Anteil am experimentellen
Fehler,
-Abweichung immer in die gleiche Richtung (positiv oder negativ)
-kann durch eine große Anzahl von Wiederholungsmessungen nicht
minimiert werden,
-beieinflußt die Richtigkeit einer Methode
-kann unter Umständen durch mathematische Methoden
minimiert werden
Improving trueness
Systematischer und zufälliger Fehler
Improving
accuracy
Error
Improving precision
Systematische Fehler
A = x – , -wahrer Wert
Der Mittelwert sagt nichts über die Genauigkeit der Methode!
Systematische Fehler bedingen die Richtigkeit eines Ergebnisses.
-Können durch Korrekturen erfaßt und eliminiert werden.
-Abweichungen stets im gleichen Sinn (positiv oder negativ)
additiv
(Blindwert)
multiplikativ
(falsche Titereinstellung)
nichtlinear
Einsatz von Referenzmaterialien zur Validierung
Concentration
certified concentration
Zum Auffinden systematischer Abweichungen
Reproduzierbarkeit (früher: Präzision)
Ermittlung der Standardabweichung (statistische Abweichung um einen
Mittelwert)
3 Stufen:
Wiederholbarkeit: gleiches Labor, gleiches Gerät, gleiche Person, kurzes
Zeitintervall (9 Wiederholungen im ges. Bereich bzw.
6 Wiederholungen bei 100 % der Testkonzentration)
Mittlere Präzision: gleiches Labor, anderes Gerät, andere Person, über
längeres Zeitintervall
Vergleichbarkeit:
anderes Labor, anderes Gerät, andere Person
(Beispiel Ringversuche)
Hohe Präzision ist keine Gewähr für die Genauigkeit eines Ergebnisses!
Kalibrierung
-Darstellung des Zusammenhangs zwischen einer Eingangsgröße
(analytische Information) und einer Ausgangsgröße (Messsignal)
-Unterschied zu Regression und Korrelation:
Eingangs- und Ausgangsgröße sind nicht unabhängig voneinander
Messprobe
xi (Ai)
latente
Informationen
über n Analyte
Ai (i=1,…..,n)
und deren
Mengen xi
Messung
chemischer
Eigenschaften
Ai
xi
zi
yi
Codierung der
Probeninformation
Messergebnis
Signalfunktion
yi (zi)
Intensitäten
yi in
charakterist.
Positionen zi
Erzeugung von
Messfunktionen
z  L( A)  f ( A)  qualitiative Analyse
y  M ( x)  f ( x)  quantitative Analyse
L, M-lineare Operatoren
Kalibrierung
Prozess zur Feststellung, wie das Signal einer
Messmethode in Abhängigkeit von den gegeben
Parametern variiert.
Bekannte Menge eines Analyten (z. B. durch Nutzung von
Standardlösungen oder Referenzmaterialien) wird der
Messmethode unterworfen und das Signal gemessen.
Ziele:
-Auffinden einer mathematischen Funktion, die die
Abhängigkeit eines Systemparameters (z. B.
Konzentration des Analyten) vom gemessenen Signal
beschreibt
-Gewinnung statistischer Informationen über das
Analysensystem
 Auffinden der Kalibrierfunktion
 Auswahl des Arbeitsbereiches
 Messung verschiedener Kalibrierstandards
 Lineare Regression
 Test einer nichtlinearen Regression
 Test der Homogenität der Abweichungen
 Berechnung der statistischen Kenngrößen
Absicherung des unteren Arbeitsbereiches (LoD,
LoQ)
Absicherung des oberen Arbeitsbereiches
Mögliche mathematische Funktionen
 Einfache lineare Regression mit Durchgang durch den
Koordinatenursprung
y=mx
 Lineare Funktion mit Anstieg a und Schnittpunkt b
y = ax + b
 quadratische Funktion
y = ax2 + bx + c
 kubische Funktion
y = ax3 + bx2 + ax + d
 Exponentialfunktion
y = a ebx
Lineare Regression
a, b werden über die Quadratsummen Qxy, Qx und Qy erhalten
Aufstellung eines Modells
yˆi  a  bxi
und
Minnimierung der Fehlerquadrate
yi  a  bxi  eyi
n
2
 ey  min
i 1
i
Vorraussetzungen:
-Gehalte der Kalibrierproben sind weitgehend fehlerfrei bzw. die Fehler sind
gegenüber denen der Messgröße y zu vernachlässigen
-Die Fehler der Messgrößen sind homoskedastisch, d.h. in den verschiedenen
Kalibrierpunkten konstant (F-Test).
-ansonsten gewichtete Kalibrierung
Ermittlung der Koeffizienten a und b:
Qx    xi  x 
2
Qy    yi  y 
2
Qxy    xi  x  yi  y 
b
Qxy
Qx
Standardabweichung der Reste ist ein Maß
für die Streuung der Messwerte um die
Kalibriergerade
Standardabweichung des Verfahrens ist
ein Maß für die Leistungsfähigkeit
a  y  bx
1 n
2
sy 
  yi  yˆi 
n  2 i 1
sx0 
sy
b
Wichtig: Darstellung der Residuen!
Bei gleichmäßiger Streuung ist Annahme der linearen Kalibrierung gerechtfertigt.
Einfluß von Ausreißern:
Problem: nichtlineare Zusammenhänge, Ausreißer, „Datenwolken“
Vier Beispiele mit gleichem Korrelationskoeffizienten 0.816
Varianzenhomogenität
Messwerte der Kalibrierfunktion sollten konstant um die Kalibriergerade streuen.
Empfindlichkeit
Wie stark reagiert ein Messergebnis auf Konzentrationsänderungen
(Anstieg der linearen Kalibrierkurve)
Bestimmungsbereich
Das Massen- bzw. Konzentrationsintervall, in dem der zu bestimmende
Stoff mit angegebener Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann.
Nachweisgrenze: kleinste Menge des Analyten in der Probe, die
qualitativ noch erfasst werden kann (Ja/Nein Entscheidung)
Bestimmungsgrenze: kleinste Konzentration des Analyten in der Probe,
die quantitativ noch erfasst werden kann.
Nachweisgrenze-Limit of Detection (LoD)
• LoD: die niedrigste Konzentration eines Analyten, die
noch nachgewiesen werden kann (unterscheidbar vom
Rauschen), auch 3-Nachweisgrenze
– LoD = B+3S0 or 0+3S0
B=Blank
• S0=Standardabweichung von mindestens 10
wiederholten Messungen
Bestimmungsgrenze-Limit of Quantitation (LoQ)
- LoQ = B+10S0
Nachweisgrenze, Erfassungsgrenze, Bestimmungsgrenze
Robustheit
•
Einfluss von Umweltfaktoren oder Prozessbedingungen
•
•
•
•
•
•
•
Temperatur, Druck
Reagentien ( z. B. unterschiedliche Chargen)
Extraktionszeit
Zusammensetzung der Probe
Rührgeschwindigkeiten
usw.
kann über Wiederfindungsfunktion ermittelt werden
Kalibrierfunktion:
y ac  bc x
Analysenfunktion:
x
Lineare Wiederfindungsfunktion:
x f  a f  b f xc
y f  ac
bc
ac, bc = bekannte Koeffizienten der Kalibrierfunktion
yf yc = Signalwert der Probe mit bekanntem Gehalt xc
xf = berechnetes Messergebnis der Probe xc
af, bf = Koeffizienten der Wiederfindungsfunktion
xf
Konstant-systematischer Fehler:
x f  xc , a f  0, b f  1
Idealfall
x f  xc , a f  0, b f  1
Proportional-systematischer Fehler
x f  xc , a f  0, b f  1
xc
Zeitstabilität
Verschiedene Möglichkeiten der Bestimmung
einer unbekannten Konzentration
 Externe Standards, Kalibrierkurven
 Interne Standards
 Standardaddition