Transcript 优质特色畜禽新品种选育与扩繁技术

中国棉花主栽品种DNA指纹库构建
关键技术研究
汇报人：匡
猛
中国农业科学院棉花研究所
汇报内容
一、研究背景
 二、指纹库构建研究进展
 三、非纯位点与杂株的鉴别
 四、重点与难点
 五、相关科研成果

一、研究背景
2000-2009年，我国通过国家审定及省级审定的棉花品
种数量达700多个；
 截止到2014.06.30，申请品种权保护的棉花品种数量
达447个；
 少数骨干亲本的集中使用，棉花品种间的遗传差异越
来越小；
 以形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，且形态
鉴定时效性差，容易受到主观与环境因素的影响；
——
导致棉花品种多、乱、杂的混乱局面难以得到有
效控制，给品种权拥有者、使用者和生产上造成严重
损失。

田间形态鉴定为主
棉
花
品
种
鉴
定
品种剧增
遗传基础狭窄
迫切需要开发新的鉴定技术
DNA指纹技术
RFLP
RAPD
SSR
SNP
AFLP
棉花品种DNA指纹库构建
广泛的应用领域
真实性与纯度鉴定
新品种DUS测试
侵权案司法鉴定
区试品种监控
种质资源遗传多样性
国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中，
已将构建DNA指纹数据库的方法确定为SSR和SNP，其中SSR
标记因其技术比较成熟，已得到广泛的应用。
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然而，基于常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测
方法在分析的材料和位点较多时，检测工作显得费时费力，
且不同胶板间数据的整合与统计是一项很繁琐的工作，数
据结果的准确性也很难保证。
毛细管电泳检测平台
毛细管电泳检测平台是以不同颜色的荧光染料标记在
SSR引物的5′端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增
产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行
比对，可自动读取产物片段大小，大大提高检测效率的
同时保证了数据的准确性，尤其适用于大规模材料的检
测分析与指纹数据库的构建。
研究进展
本课题在已有的研究基础上，利用36对SSR核心引物，
首次采用多色荧光标记检测技术开展我国棉花主栽品种
DNA指纹数据库构建的研究工作，开发了棉花DNA指纹数据
库软件管理系统，代替人工进行数据统计与分析，使鉴别
和研究更快捷、准确，初步建立了高通量的棉花DNA指纹
检测与数据分析平台。
供试材料
初次入库的棉花品种合计138份，其中包括
2007—2009年连续3年的农业部全国棉种质量抽查
项目获得的，来源于我国三大棉区的主栽品种101
份，中棉所(CCRI)系列品种37份（包括4份常规种
与11份杂交种及其亲本）。
部分供试材料基本信息
荧光峰型表现形式
A.尖锐单峰—41.7%
B.连续多峰—30.6%
C.N+1峰—27.8%
三种主要荧光特异峰峰型
杂交种峰型特点
亲本1
亲本2
杂交F1
A.双峰
B.三峰
C.四峰
荧光多重PCR组合的建立
基本原则：
①组合中各引物的扩增产物片段范围不能交叉；
②避开非特异扩增产物峰的相互影响；
③采用多色荧光染料进行标记；
④对于扩增效率较低的引物优先使用FAM进行标
记；
⑤选择SSR左右引物中较好的5′端进行荧光标记，
尽量避开二聚体结构。
36对建库所用SSR核心引物构建了9个4重PCR组合，每个组
合中的4个引物分别以FAM、HEX、TMR和ROX 4种不同颜色的荧
光染料在5′端进行标记。
荧光多重PCR组合
四色荧光多重PCR组合的毛细管电泳检测效果
注：橙色为分子量内标Liz-500
棉花DNA指纹数据库软件管理系统
实现了五大功能：
— 品种信息查询；
— 品种比较；
— 亲子鉴定；
— 特异性鉴定；
— 指纹图谱绘制；
(1)品种信息查询功能
查询品种基本信息,关联其指纹信息、形态信息及系谱信息
品
种
指
纹
信
息
品种形态信息
品种系谱信息
(2) 品种比较
品种间两两比对,比对结果显示比较位点数、差异位点数及相似度
(3) 亲子鉴定
鉴定假设杂交种F1组合与假设双亲间是否存在亲子关系，比对结
果显示比较位点数、杂合位点数及亲权排除位点数。
注：亲权排除位点数≥2个，判定为不具有亲子关系。
(4) 特异性鉴定
通过设置差异位点数， 将某品种与数据库中其他所有品种
指纹进行指纹比对分析，进行特异性鉴定。
(5)指纹图谱绘制
自动绘制品种模式指纹图谱, 类似于条形码功能；
同名品种指纹差异分析
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相同年份、不同来源的同名品种 ；
共9对，差异位点数均在0-2个之间—100%；
不同年份、相同来源的同名品种 ；
共13对，差异位点数:0-2个之间，10对—76.9%;
4-5个之间，3对---23.1%;
不同年份、不同来源的同名品种；
共11对，差异位点数:0-2个之间，10对—90.9%;
11个
， 1对— 9.1%；
相同来源、相同年份、不同批次的同名品种 ；
共2对，差异位点数：0个；
本研究初步将≥3个差异位点为不同品种的判别标准。
(与即将发布的玉米和水稻分子鉴定国家标准是一致的)
三、非纯位点与杂株的鉴别
通常所说的品种纯度，实际上是遗传水平上的DNA位点纯合度
与种子生产过程中混杂程度的综合表现，混杂样品与非纯位点
均表现为不同于主要基因型的异常基因型。然而，种子混杂和
非纯位点所反应的现象却有本质的差别。
利用分子标记对主要农作物品种纯度的研究多有报道，但是多
将种子混杂和DNA位点的不纯混为一谈，未能有效区分遗传因素
和种子生产加工所致的混杂对品种纯度造成的影响，因此无法
准确反应品种纯度特性。
种子混杂(杂株)：由生物学混杂、机械混杂或人为
掺杂所致，一般情况下，多个位点均表现为不同于主要
基因型的异常基因型；
注：7号与9号样品为杂株(均在3个位点表现为异常基因型)；
非纯位点
一方面是由于在传统的遗传育种过程中，育种家侧重对重要农
艺性状和易于观察鉴别的植物学特征进行选择，不可能对全
基因组施加选择压力，从而导致某些遗传交换频率较低的位
点通常保持父母本DNA片段的杂合状态，并在后代群体中保
持孟德尔式的遗传分离；
另一方面可能是由于某些品种自交代数不够，部分位点尚未纯
合。因此，可以通过增加自交代数，系统选育出位点纯合率
高的品种，以提高品种的一致性与稳定性。

非纯位点

I0 (组合)
Aa(100%)
I1 AA(25%) Aa(50%) aa(25%)
I2 AA(37.5%) Aa(25%) aa(37.5%) 注：I1代没有提纯
I3 AA(43.75%) Aa(12.5%) aa(43.75%) 注：I2代没有提纯
I4 AA(46.875%) Aa(6.25%) aa(46.875%) 注：I3代没有提纯
I5 AA(48.4375%) Aa(3.125%) aa(48.4375%) 注：I4代没有提纯
……………………………………………….
注：各世代中等位变异A与a所占比例理论上均符合1:1
非纯位点
F基因型：编号为1、2、3、10、12、14、15、17 的样品，共8个；
M基因型：编号为 4、5、6、7、8、9、11、13、18的样品，共9个；
杂合基因型：编号为16、19、20的样品，共3个；
1:1卡方适应性测验，χ2 =0.04<χ2 (0.01,1)=6.64，
此位点的两种等位变异按1:1分离，符合孟德尔遗传分
离规律，判定为非纯位点。
进行棉花品种纯度的SSR标记位点分析时，
需区分遗传不稳定所致的非纯位点与生产加工
过程中的种子混杂，明确鉴别位点纯合度与种
子生产纯度两个指标，才能获得更客观准确的
纯度鉴定结果，具有针对性地指导棉花遗传育
种、品种审定、种子生产与加工。
四、重点与难点
棉花作为常异花授粉的四倍体作物，其基因组与遗传
背景相对二倍体作物(如玉米和水稻)更为复杂，品种内部
的高度一致性很难保证，如何准确鉴别品种间与品种内部
剩余变异所致的差异，一直都是未能很好解决的难题。
同时，由于四倍体的特性，不同棉花品种的基因型可
能表现为单峰、双峰、三峰及四峰(基于毛细管电泳检测平
台)，给数据采集与统计分析带了很大的难度与挑战。
五、科研成果
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相关科研论文
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Research. (Accepted)
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[5]匡 猛,杨伟华*, 张玉翠等.棉花杂交种纯度的SSR标记检测及其与表型鉴定的相关性,作物学
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六、科研成果
获得授权发明专利3项，
实用新型专利1项，
计算机软件著作权1项。
小结
棉花品种DNA指纹数据库的建立，不仅对保护棉花育成品
种的知识产权和育种家的权益、提供棉花种子真实性和纯度
的司法鉴定具有重要意义，而且对规范品种管理，提高市场
的种子质量水平，控制品种多、乱、杂，打击假冒伪劣，维
护棉花生产和棉农利益以及进一步清理我国棉花种质亲缘关
系等方面都是非常必要的。
然而，DNA指纹数据库的构建及应用是一个复杂的系统工
程，涉及多方面的问题还有待进一步的深入研究。
致谢
感谢农业部种子管理局、农业部种植业司、全国农技推广
中心对本研究的大力支持；
基金项目：
中央级公益性科研院所基本科研业务费重点项目(SJA1204)；
农业部农产品质量安全监管(种子管理)项目；
国家科技支撑计划(2011BAD35B09)；
国家棉花产业技术体系(CARS-18-24 );
项目合作单位：
华中农业大学林忠旭课题组； 山东棉花中心张军课题组；
南京农业大学蔡彩平课题组；