Transcript IDB HC 6 Eiwitzuivering 2

Eiwitzuivering 2
Kwantificeren van eiwitten
PAGE en SDS-PAGE
Iso-electric focussing
2D PAGE
TBEMH-P05IDB HC6
Sigrid Beiboer en Ivo Horn
Kwantificering
OD280 of A280
 Kleuring door complexvorming

Spectrofotometrische bepalingen:
• waarden tussen 0,1 en 1,0!!!!!!!!!!!!
• blanco stellen met buffer
Kwantificering, OD280





Eiwit absorbeert
specifiek bij 280 nm
Tyr en Trp en in mindere
mate Phe (Y, W en F)
pH en T hebben invloed
op absorptie
Abs. 220 en lager:
peptideband in eiwit
Afhankelijk van aantal az
met ringstructuur!
Kwantificering dmv kleuring

Meestal in mg/ml, tenzij precies de code
bekend is (dan in molair)

Kleuring door complexvorming, vb:
◦
◦
◦
◦
Bradford
Biureet reactie
Folin-Lowry
BCA
Kwantificering, Bradford
Binding Coomassie Brilliant Blue G-250
aan eiwit
 Rood, na binding in zuur milieu blauw
 Meting bij 595 nm
 Bindt niet i.a.v. bepaalde detergentia, bijv
deoxycholaat, triton X-100, NP-40

Kwantificering, Biureet reactie
Koperionen binden aan peptidebanden
 Reductie Cu2+ naar Cu+
 OD545
 Onafhankelijk van soort aminozuren

Kwantificering, Folin-Lowry
Biureetreactie gevolgd door reductie
van fosfomolybdaat door Y, W, C, H
en peptidebanden
 Blauwe kleur bij 745 nm
 Zeer nauwkeurig

BCA bepaling




Principe gelijk aan Lowry
Door bicinchoninic acid veel gevoeliger
Minder gevoelig voor detergentia
OD562 en lineair tot OD562=2
Elektroforese, scheiding van eiwitten
Moleculaire zeef in gel
PAGE: polyacrylamide gel elektroforese
Polymerisatie van acrylamide met N,N’-methyleen
bisacrylamide mbv katalysator
Percentage crosslinker (bisacrylamide)
% Crosslinks bepaalt mechanische eigenschappen gel en
gemiddelde diameter van de poriën

Meestal stockoplossing van acrylamide : bisacrylamide = 29,2 : 0,8

Stockoplossing wordt gefiltreerd (0,4 um) en in donker bij 4ºC
bewaard
poriediameter

Percentage totaal acrylamide
Marker:
1. Myosin, 205 kDa
2. Beta-galactosidase,
116 kDa
3. Phosphorylase, B 92
kDa
4. BSA, 66 kDa
5. Egg albumin, 45 kDa
6. Carbonic anhydrase,
29 kDa
www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/rf.html
Grote eiwitten
Kleine eiwitten
(Dalton is gewicht proton)
laag percentage acrylamide
hoog percentage acrylamide
Katalysatoren

10% ammoniumpersulfaat (10% APS, bij -20ºC
bewaren) en N,N,N’,N’-tetramethyleendiamine
(TEMED, donker bewaren bij 4ºC)

Aard van katalysator heeft invloed op poriediameter

Concentratie van katalysator heeft invloed op
structuur van de gel
Continue buffersysteem


1 gel, 1 buffer
Geen concentrering van eiwitten, dikkere bandjes
◦ Kan een beetje voorkomen worden door:
 sucrose vlak voor monster oplading op de gel op te brengen
 kleinere ionen uit het monster te halen (dialyse)

Betere scheiding door eerst met laag voltage en later met
hoog voltage te elektroforeren
PAGE met discontinue pH
Een discontinu systeem bestaat uit 2 gellagen:
• Stacking gel: 3% acrylamide, gel met grote mazen. Monster wordt
geconcentreerd en eiwitten gerangschikt naar hun mobiliteit
• Separation / running gel: ±10% acrylamide, gel met kleine mazen,
waarin scheiding plaats vindt
Tris+
Glycine-
Tris+
Cl-
Tris+
Cl-
Kathode
Anode
pH 8,3
Elektrodevat
pH 6,8
Stacking gel
pH 8,8
Running gel
Glycine
pK aminogroep: 9,8
pK carboxylgroep: 2,4
IEP: (9,8 + 2,4)/2 = 6,1
Buffers met verschillende pH regelen de mobiliteit van
de elektrolyten
• pH monsterbuffer en stacking gel zijn gelijk (6,8)
• IEP van glycine is 6,1
geringe negatieve nettolading
traagste elektrolyt in stacking gel
• Kleine Cl- ion is leidend elektrolyt
• Hiertussen liggen de mobiliteiten van de eiwitten
Rangschikking van eiwitten naar mobiliteit
Eiwitzones concentreren zich
• Grensvlak stacking en running gel
toename pH tot 8,3 van elektroforesebuffer
• Running gel heeft kleine poriën en lage potentiaalgraad:
migratiesnelheid van eiwitten neemt sterk af
• Glycine bij grensvlak:
- toename in dichtheid running gel
- pH stijging naar 9,5 (glycine wordt sterk negatief)
- mobiliteit van glycine neemt sterk toe
• Scheiding van eiwitten door moleculaire zeefwerking
SDS-PAGE

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Poly
Acrylamide Gel Electrophoresis (Laemmli)

SDS geeft eiwitten een negatieve lading

Scheiding van eiwitten op molecuulmassa

Molecuulmassa bepaling van eiwitten mbv marker

Indicatie aantal en hoeveelheid van eiwit
(subeenheden) in een monster
PAGE van IgG moleculen (antilichamen)
• Totaal 150 kDa
• 2 zware ketens van elk 50 kDa
• 2 lichte ketens van elk 25 kDa
(1 dalton = massa 1 proton)
Bevat zwavel bruggen tussen:
• de zware ketens
• de zware en lichte ketens
• Natieve PAGE: een brede zone
• SDS-PAGE: een bandje van 150 kDa
• SDS-PAGE + DTT: 2 bandjes van 25 kDa en 2 bandjes van 50 kDa
SDS-PAGE van IgG moleculen
SDS-PAGE
Biorad minigel systeem
Gieten van de gel en runnen
SDS PAGE op youtube:
Pouring the gel
http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&feature=fvw
Running the gel
http://www.youtube.com/watch?v=5eMsgidAY5E&feature=related
Gel cassette in elkaar zetten
Gieten van de gel
Elektroforese cassette
Monster laden op gel
Sample buffer bevat de volgende stoffen:
 Broomfenolblauw: hoge mobiliteit,
detecteert migratie bufferfront
 Glycerol: eiwitdaling in slotje
 SDS
 Tris buffer pH 6,8
Elektroforeren
Gel wordt gerund bij 40 mA of 100 V
Fixatie en kleuring
Fixatie om bandverbreding door diffusie tegen te gaan
Kleurmethoden:
 Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB), hergebruik mogelijk
◦ CBB in water/methanol/ijsazijn (detectiegrens is 0,2-0,5 ug eiwit)
◦ Snellere, groffere, slechtere kleuring: CBB in trichloorazijnzuur
◦ Ontkleuring met isopropanol of methanol in azijnzuur
 Zilverkleuring
◦ 10 tot 100 x gevoeliger dan CBB
◦ Kleuring niet voor alle eiwitten lineair met concentratie
 Fluorescerende labels aan eiwitten gekoppeld
 Radioactieve labels aan eiwitten gekoppeld
 Immunologische detectie (Western blot)
 Detectie van enzymen (in H05PBM: 4CIN/waterstofperoxide
oplossing  toont alleen peroxidase enzym aan)
Resultaat coomassie kleuring
Resultaat zilverkleuring
Overige kleuring manieren
4CIN/waterstofperoxide oplossing
toont peroxidases uit verschillende
groenten (H05PBM)
Radioactiviteit
Vraagje
• Welke moleculen uit een cel kunnen worden
gedetecteerd op SDS-PAGE?
• Alleen eiwitten van interesse
• Alle eiwitten
• Zowel eiwitten als DNA
• Alles: eiwitten, DNA en overig celmateriaal
Isoëlektrisch punt, IEP of pI
pH waarbij nettolading van eiwit nul is
IEP of pI is afhankelijk van:
- aminozuursamenstelling
- volgorde van aminozuren
Isoëlektrische focussering
• pH gradiënt over gel aangebracht
• Samples worden op gel geladen
• pH op opbrengplek:
– pH > pI eiwit: eiwit negatief: migreert naar positieve anode
– pH < pI eiwit: eiwit positief: migreert naar negatieve kathode
• Migratie van eiwit stopt op die plek waarbij pH = pI
• Marker mee om pI te bepalen
Instelling gradiënt
Anode
6H2O
O2 + 4H3O+ + 4e-
Kathode
4H2O + 4e-
2H2 + 4OH-
Verschillende amfolyten worden op gel gebracht
Kathode
+
-
Elektroforese
+
-
+
-
gradiënt stelt zich in
lineaire pH gradiënt
Anode
pH bereik
Scherpe pH-overgangen aan uiteinden van de gel:
bereik van gradiënt komt niet overeen met pH-waarden van
de elektrode oplossingen
Aandachtspunten
• Amfolytconcentratie > 2%
• Amfolyten mogen niet meekleuren
– zonodig verwijderen met 5% TCA
• Spanning (V) zo hoog mogelijk instellen na instelling pH gradiënt,
runnen op constant vermogen (bijv. 30 Watt)
Voorbeeld Isoëlektrische focussering
2D-elektroforese
1. Isoëlektrische focussering
2. SDS-PAGE
Resultaat 2D-elektroforese
Via http://us.expasy.org en
SWISS-2DPAGE nog meer
Welk eiwit?
Marker nodig
Afstanden meten; schatten visueel
Computer software
Internet database
Vergelijkbare 2D gels
Bepaling molmassa of pI
mbv afstanden meten
Wilson & Walker, Campbell & Farrell
7e editie
7e editie
 H3: 3.1-3.4.2
 H5: 5.1-5.3
 H8: 8.1-8.3.4
 H5: 5.4 lezen
 H10.2.2-10.3.5 & 10.3.7
 H11:11.1.1-11.1.2,
11.2.1-11.2.2,
11.6-11.8.2 & 11.8.4
W&W H11 gaat over chromatografie, wat in IDB HC7 wordt behandeld