Transcript Alu-TPA PCR Kit

Praktikum:
Nachweis einer gentechnischen
Veränderung in Lebensmitteln durch
PCR
Vorbereitung Lehrer
Für jede Arbeitsgruppe werden
550 µl InstaGene-Matrix aliquotiert!
Das Tube wird mit „IG“
beschriftet!
Vorbereitung
Lehrer
I.
1.
DNA-Extraktion
Vorbereitung
1.1 Beschriften Sie 2 Schraubtubes mit:
- non GMO (-GMO)
- Lebensmittelprobe (T)
und Ihrer Gruppennummer!
I.
DNA-Extraktion
1.2 Pipettieren Sie jeweils 250 μl der durch
Auf- und Abpipettieren homogenisierten
InstaGene-Matrix aus Ihrem Vorratstube
(„IG“ mit 550 µl Gesamtvolumen) in die
beiden beschrifteten Tubes!
Überstand
Beide Tubes sollten etwa
die gleiche Menge
InstaGene-Perlen
enthalten!
I.
DNA-Extraktion
2.
DNA-Extraktion aus „nicht
GV- Lebensmitteln (-GMO)“
2.1
Wiegen Sie 1 g des nicht gentechnisch veränderten Lebensmittels (-GMO) ab und geben
Sie es in einen Mörser!
2.2
Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!
I.
DNA-Extraktion
2.3 Homogenisieren Sie das
Gemisch etwa 5 Minuten!
2.4 Pipettieren Sie weitere
5 ml H2Odest. hinzu und
zermörsern Sie weiter,
bis ein pipettierbarer
Brei entstanden ist!
I.
DNA-Extraktion
2.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebensmittelbreis in das mit „-GMO“
beschriftete Schraubtube (Inhalt des
Schraubtubes 250 µl InstaGene)!
2.6 Verschließen Sie das
Tube und durchmischen
Sie durch Anschnippen!
Um Kontamination mit +GMO-DNA zu
vermeiden, wurde zuerst das -GMO-Material
extrahiert!
Die Reinigung von Mörser und Pistill erfolgt
mit einem Detergenz z.B. „Pril“. Danach wird
mit H2Odest. nachgespült.
I.
3.
DNA-Extraktion
DNA-Extraktion aus zu
testendem Lebensmittel (T)
3.1 Wiegen Sie 1 g des zu testenden
Lebensmittels (T) ab und geben Sie es in
einen Mörser!
3.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!
I.
DNA-Extraktion
3.3 Homogenisieren Sie das Gemisch
etwa 5 Minuten!
3.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml
H2Odest. hinzu und zermörsern Sie
weiter, bis ein pipettierbarer Brei
entstanden ist!
I.
DNA-Extraktion
3.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebensmittelbreis
in das mit ("T") beschriftete Schraubtube
(dieses enthält bereits 250 µl InstaGene)!
3.6 Verschließen Sie das Tube und durchmischen Sie durch Anschnippen!
Reinigung
Reinigen Sie den Mörser und Pistill
mit einem Detergenz!
I.
DNA-Extraktion
4.
Enzymdenaturierung bei 95°C
4.1
Inkubieren Sie die beiden
Schraubtubes 5 Minuten
bei 95°C im Wasserbad!
95oC
4.2 Zentrifugieren Sie die Tubes 5 Minuten
bei 13000 Umdrehungen pro Minute!
Beachten Sie:
Bei der Entnahme der Kontroll-DNA
(-GMO) und der DNA der
Lebensmittelproben (T) aus den
Schraubtubes darf nur der
Überstand ohne InstaGenePerlen entnommen werden!
Bedeutung der InstaGene-Matrix
InstaGene-Matrix ist negativ geladen
 bindet vorhandene Kationen
 Kationen dienen als Cofaktoren von Enzymen,
wie z. B. der DNasen
 DNasen werden nicht aktiviert
 DNA-Abbau wird verhindert
Aber: InstaGene-Matrix bindet Mg2+-Ionen und
hemmt damit die Polymerase bei der PCR
Aufbewahrung der Proben
Die Tubes können im Kühlschrank
(bei 8oC mit der Matrix) über Tage
aufbewahrt werden!
I.
DNA-Extraktion
Entnahme des Überstandes
4.3 Überführen Sie jeweils 50 µl des
Überstandes aus Ihren Tubes in zwei
neue, zuvor entsprechend beschriftete
Tubes (–GMO, T)!
Ansetzen des PCR-Master-Mix
Zu beachten ist:
Gebrauchsfertiges Gemisch aus PCR-Master-Mix
mit Primern darf bis zum Start der PCR nicht
länger als 30 Min. auf Eis stehen!
Innerhalb dieser 30 Min. müssen alle Proben für die
PCR angesetzt sein!
Eis richten!
Achtung!!!
Nach dem Auftauen:
• der Taq-Polymerase
• und des Master Mix
die Tubes vor dem Öffnen
zentrifugieren!
Ansetzen des MolekulargewichtsStandards durch den Lehrer
• Pipettieren Sie 30 µl Orange-D-LoadingDye zum Molekulargewichts-Standard!
• Tube auf Eis stellen!
Aliquotieren des PCR-Master-Mix
durch den Lehrer
• Jeweils 300 µl PCR-Master-Mix werden zu
den Plant Primern (6 µl)
und
GMO Primern (6 µl)
pipettiert!
• Tubes auf Eis stellen!
Vorbereitung: PCR und Elektrophorese
in Gruppenarbeit (20`)
Jede Arbeitsgruppe bereitet für alle
weiteren Gruppen entsprechend Ihrem
Arbeitsauftrag einen Teil der PCR oder
der Elektrophorese vor.
Arbeitsaufträge
Tubes pro Arbeitsgruppe nach der
Gruppenarbeit
+GVO
-GVL
T GMM PMM LD MWR
6 PCR-Tubes
Ansetzen und Durchführung
der PCR (200`)
1. Nummerierung der PCR-Tubes
1.1 Nummerieren Sie Ihre PCR-Tubes 1 - 6!
1.2 Pipettieren Sie die PCR-Ansätze nach
folgender Tabelle!
Nr.
Master Mix
DNA
1
2
10 µl PMM
10 µl GMM
10 µl –GVL (Kontrolle)
10 µl –GVL (Kontrolle)
3
4
10 µl PMM
10 µl GMM
10 µl Lebensmittelprobe (T)
10 µl Lebensmittelprobe (T)
5
6
10 µl PMM
10 µl GMM
10 µl +GVL (Kontrolle)
10 µl +GVL (Kontrolle)
MM: Mastermix; GVL: gentechnisch verändertes Lebensmittel
III. Ansetzen und Durchführung
der PCR
1.3
Durchmischen Sie ihre PCR-Ansätze
durch Auf- und Abpipettieren!
Zentrifugieren Sie Ihre PCR-Ansätze
falls notwendig 1 Minute bei 1000
Umdrehungen!
1.4
Kühlen Sie Ihre PCR-Ansätze im Eis bis zum
Beginn der PCR!
III. Ansetzen und Durchführung
der PCR
- Um Verwechslungen zu vermeiden tragen
Sie die Position Ihrer Proben im
Thermocycler auf dem Übersichtsblatt ein!
Übersichtsblatt
- Tubes müssen gut verschlossen sein!
III. Ansetzen und Durchführung
der PCR
2.
Durchführung der PCR
Führen Sie die PCR entsprechend dem
Temperaturprogramm am Thermocycler
durch!
CyclerProgramm
DNA-Amplifikation
120``, 94°C
CyclerDenaturation
Programmierung
60``, 94 °C
Denaturation
40 Zyklen
10`, 72 °C
Completing
120``, 72 °C
Elongation
60``, 59 °C
Annealing
Durchführen der PCR
Cycler-Programmierung:
Denaturieren
94 oC
2 Min.
40 Zyklen:
Denaturieren
94 oC 1 Min.
Primeranlagerung
59 oC 1 Min.
DNA-Neusynthese
72 oC 2 Min.
Vervollständigung der neuen Stränge:
72 oC 10 Min.
Dauer: ca. 3 Stunden
Ende der PCR
Nach der Amplifizierung können die Proben bei
– 20oC im Eisfach
oder über Nacht bei 4oC im Cycler bis zur
Gelelektrophorese aufbewahrt werden.
IV.Nachweis der PCR–Produkte durch
Elektrophorese (Agarose/PAGE)
1.
2.
Führen Sie den Nachweis der PCR-Produkte
entsprechend Ihres Arbeitsauftrages als Agaroseoder Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch!
Färben Sie Ihre Gele entsprechend Ihres Arbeitsauftrages und werten Sie diese aus!
Arbeitsgruppe 1 - 4
Arbeitsgruppe 5 - 8
AgaroseGelelektrophorese
Befüllen
des Gels
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