Transcript bioform - Liceo Socrate

La nostra esperienza
all’Istituto Ebri-CNR
Tipizzazione del gene
PV 92
Per Alu
Individuazione di Elementi Alu sul
cromosoma 16
• Come è noto il nostro corredo cromosomico è costituito da un
numero diploide pari a 46 cromosomi
• PV92 è un gene localizzato sul cromosoma 16
• L’inserimento di un retrotrasposone Alu avvenne, come evento
mutazionale, in un soggetto (fondatore) migliaia di anni fa
• I possibili genotipi del PV92 per ALU sono: +/+ +/- -/• Questa tipizzazione è usati in genetica delle popolazioni, in analisi di
paternità e in medicina forense.
• Non si ha alcuna associazione con fenotipi.
Cromosoma 16 PV92 ALU
Cromosoma 16
Alu
PV92
Alu
PV92
PCR “reazione a catena della
polimerasi”
• Nel 1989 è stato messo a punto un processo, noto come PCR
(reazione a catena della polimerasi), in grado di sintetizzare milioni
di copie di un segmento di DNA in tempi assai brevi e con una
procedura relativamente semplice
• La PCR richiede una certa conoscenza del segmento da copiare ed
amplificare, di cui deve essere nota una sequenza di circa due
dozzine di basi, all’estremità 3’ dei due filamenti che costituiscono il
segmento da amplificare
• Infatti è necessario predisporre due iniziatori specifici, di circa 15-20
basi, che possano favorire l’innesco della duplicazione del
frammento di DNA da amplificare, riconoscendone le estremità 3’
dalle quali inizia la duplicazione
• Grazie all’unicità delle sequenze del DNA , i due iniziatori (PRIMER)
legheranno solo la regione del DNA per la quale sono stati
predisposti.
• Quindi in una preparazione contenente l’intero genoma umano,
costituito da tre miliardi di coppie di basi, gli iniziatori predisposti
interagiranno solo con il segmento genico sul quale si sta
lavorando.
3) Valutazione dei risultati
PV92
Senza Alu
415 bp
Regione da amplificare
PV92
Con Alu
715bp
300bp
Regione da amplificare
I banconi sono organizzati con micropipette e relativi puntali, provette e
portaprovette, kit con reagenti, in postazioni predisposte per due allievi
che lavoreranno individualmente. Tutto il materiale viene siglato da ogni
allievo con un numero che consenta, in forma anonima,l’attribuzione
della tipizzazione.
1. Viene effettuato uno sciacquo boccale energico con soluzione
fisiologica, per 1 minuto. Lo sciacquo viene raccolto nel bicchiere
usato da ogni allievo.
2. Viene prelevato con opportuna micropipetta 1 ml dello sciacquo
boccale che viene deposto in una provetta da centrifuga. Per ogni
micropipetta si utilizza il corrispondente puntale usa e getta.
3. Si effettua una centrifugazione di 1 minuto a 14.000 rpm.
4. Si verifica la formazione, per centrifugazione, di un sedimento
sufficiente (pellett di cellule) e si svuota la provetta eliminando il
sovranatante. Rimane una piccola quantità di sospensione contenente le
CELLULE della MUCOSA BUCCALE.
5. Si agita la provettina per sospendere adeguatamente le cellule, si
prelevano 30 μl della sospensione che vengono depositati in una nuova
provetta predisposta contenente:
a) sostanze basiche necessarie per la solubilizzazione degli acidi grassi
presenti nei fosfolipidi di membrana, in tal la cellula ed il nucleo si lisano; il
principio è lo stesso dei saponi che usiamo per lavarci le mani
b) resina che serve ad allontanare gli ioni metallici che successivamente
inibirebbero la DNA polimerasi
6. la provetta viene
sottoposta a
centrifugazione per 1
minuto a 14.000 rpm, poi
posta per 10 minuti in
bagnomaria a 100° C ed
ancora centrifugata per 1
minuto a 14.000 rpm. Si
ottiene così un precipitato
contenente il materiale
cellulare ormai inutile
mentre nel sovranatante
rimane il DNA.
E al Socrate………DNA e KIWI
La prima parte dell’esperienza di
tipizzazione genica, cioè
l’estrazione deI DNA dalle cellule
è stata sperimentata anche nel
nostro laboratorio dagli allievi de
quarto anno C. Ecco il protocollo
dell’ esperienza:
Materiali e Metodo: un kiwi
abbastanza maturo, un sacchetto
robusto di plastica, sale da
cucina, sapone liquido, garza,
alcool isopropilico (in alternativa
si può usare l'alcool etilico),
vetreria.
Sbucciare il frutto e tagliarlo in
piccoli pezzi da inserire nel
sacchetto di plastica. Chiudere il
sacchetto con un elastico oppure
facendo un nodo sull'apertura,
cercando di togliere prima tutta
l'aria.Frantumare la polpa con le
mani, per circa 2 minuti.
Intanto preparare una soluzione
salina, mettendo un cucchiaino da tè
di sale in 100 millilitri circa di acqua.
Quando la polpa è stata ridotta in
poltiglia, aggiungere 10 millilitri della
soluzione salina, chiudere di nuovo il
sacchetto e continuare a schiacciare
la polpa per altri 5 minuti.Nel
frattempo preparare una soluzione
con il sapone liquido (3-4 cucchiaini
di sapone in 30 millilitri circa di
acqua, mescolare senza sbattere per
evitare di produrrete troppa
schiuma). Preparare anche la garza
per la filtrazione, mettendone alcuni
strati sull'imboccatura di un bicchiere
e fermando il tutto con l'elastico.
Filtrare la polpa.
Nel filtrato aggiungere 3 millilitri circa di
sapone liquido diluito. Mescolare
delicatamente per circa 1 minuto.
Ora la fase forse più delicata: tenendo
inclinato il contenitore con il filtrato,
versare una quantità circa doppia,
rispetto al filtrato, di alcool isopropilico,
facendo attenzione a non mescolare i
liquidi. Bisogna far formare due strati,
dato che l'alcool è più leggero del
miscuglio acquoso. Per ottenere migliori
risultati è utile tenere l'alcool in frigo
per 12 ore circa, prima di utilizzarlo. Più
è freddo, meglio è.
L'alcool rende il DNA insolubile e quindi
visibile come una “massa” biancastra.
TORNIAMO ALLA TIPIZZAZIONE
7. Con la corrispondente micropipetta si prelevano con cura, evitando di
sospendere nuovamente il precipitato, 30 μl del solo sovranatante (DNA)
che si deposita in una nuova cuvetta che fornirà 2,5 μl di materiale con il
quale continuare l’esperienza, mentre i 17,5 μl residui saranno
accantonati per avere materiale di riserva in caso di errori. E’ un
passaggio in più che viene seguito per cautela.
8. A questo punto si lavora con
tre provettine:
la prima contenente 2,5 μl
con il DNA ottenuto dalle
cellule boccali,
la seconda, fornita dal kit,
contenente un agente
acido in grado di
neutralizzare il precedente
passaggio che ha reso
basica la soluzione di
DNA e il primer, cioè la
breve sequenza di
nucleotidi che deve
riconoscere il punto di
innesco della duplicazione
del tratto di DNA da
amplificare
la terza, fornita dal kit, contenete la TaQ polimerasi, cioè
l’enzima termostabile capace di catalizzare la duplicazione del
DNA anche ad elevate temperature, oltre a sali minerali con
funzione tamponante e ai desossinucleotidi trifosfati necessari
per la duplicazione della regione PV92
Si prelevano con opportune e distinte micropipette 2,5 μl dalla
prima provetta e 22,5 μl dalla seconda inserendo quanto
prelevato nella terza provetta contenente la TaQ polimerasi.
9. Ora si passa in PCR (REAZIONE A CATENA della
POLIMERASI), tutte le cuvette predisposte da ogni allievo
vengono inserite nel TERMICICLATORE che viene avviato
per compiere 30 cicli di duplicazione del DNA per un
totale di 1 ora e 15 minuti. Più precisamente il
termociclatore viene regolato per alternare 20 secondi a
95°C ad 1 minuto a 60° C allo scopo di passare da una
denaturazione del DNA (con apertura della doppia elica
per effetto dell’elevata temperatura) ad una duplicazione
(appaiamento ed estensione), catalizzata dalla TaQ
polimerasi, dei tratti delle singole eliche innescati dai
primer utilizzati.
I 30 cicli predisposti producono milioni di copie del tratto
di DNA scelto, si ottiene cioè una eccezionale
amplificazione.
… e noi facciamo merenda..
10. Mentre nel termociclatore si amplifica il DNA si prepara l’ultimo passaggio
che consiste nel l’elettroforesi del prodotto di amplificazione cioè il DNA
ottenuto. Si riscalda del gel di agarosio per solubilizzarlo e versarlo nel
contenitore (cella elettroforetica) dove, a temperatura ambiente il gel solidifica, si
aggiunge anche un equivalente del bromuro di etidio per la lettura in
fluorescenza. A questo punto con una sorta di “pettine” si scavano nel gel che
sta solidificando i pozzetti in cui verrà deposto il DNA.
11. Terminata la PCR ogni allievo riprende la propria provetta con il DNA amplificato. Gli
allievi si alternano secondo il loro numero d’ordine per caricare con il proprio campione i
pozzetti, uno per ogni allievo, della cella elettroforetica. La deposizione viene eseguita
con estrema delicatezza considerando la consistenza del gel d’agarosio e la piccola
quantità di DNA da deporre. Completata la deposizione si applica un voltaggio di 120 V
per 30 minuti. Sotto l’azione del campo elettrico il DNA di ogni allievo viene separato
sulla base del suo peso molecolare e migrerà dal polo negativo a quello positivo.
12. Alla fine della corsa
elettroforetica è possibile
visualizzare il DNA quando il
gel viene illuminato con luce
ultravioletta, grazie alla
presenza del preparato per la
lettura in fluorescenza.
13. La lettura dei risultati può
evidenziare
•una sola banda visibile di 715
bp, PV92 contiene gli elementi Alu
su entrambi gli alleli, omozigote per
l’inserzione PV92 Alu (+/+)
•una sola banda visibile di 415
bp, gli elementi Alu sono assenti
su entrambi gli alleli di PV92,
omozigote
per
l’assenza
dell’inserzione PV92 Alu (-/-)
•due bande visibili di cui una di
715 bp e l’altra di 415 bp, nel
gene PV92 Alu è presente solo su
un
allele,
eterozigote
per
l’inserzione PV92 Alu (+/-).
Esempio di un risultato
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11