Transcript Орехов-1

Фрагментный анализ ДНК
к.б.н.,Орехов В.А.
ООО «ГОРДИЗ»
29 января 2013 г.
г. Звенигород
Что такое фрагментный анализ ДНК?
Фрагментный анализ ДНК – метод (методы) определения
длины ПЦР-продуктов основанные на разделении фрагментов
ДНК по молекулярной массе.
HPLC (ВЭЖХ)
Масспектрометрия
Электрофорез
Принцип электрофореза
0’
Принцип электрофореза
30’
Принцип электрофореза
45’
Принцип электрофореза
90’
Электрофорез ДНК в геле
денатурация
Анализ фрагментов ДНК в ПААГ
-Широко использовался до конца 90-х
Преимущества:
- Не требует дорогостоящего
оборудования
- Не требует модифицированных
праймеров
Недостатки:
- Высокая трудоемкость
- Низкая пропускная способность
- Высокая себестоимость анализа (?)
- Низкая точность определения
размера фрагментов (?)
От гелей к капиллярному электрофорезу
Стеллан Хьертен
Университет Упсала(Швеция)
Первый автоматизированный прибор для
капиллярного электрофореза-1967
Капилляры Ø3мм
Не приспособлен для анализа ДНК
История капиллярного электрофореза ДНК
1988 – Разделение однонитевых олигонуклеотидов в капиллярах
заполненных поперечно сшитым гелем (Karger et al., деградация, нет
возможности перезаполнения)
1990 – разделение продуктов рестрикции ДНК в жидком полимере
(Karger et al., недостаточное разрешение)
1992 – первый коммерческий прибор для апиллярного электрофореза,
оснащенный лазером для одноцветной лазерной детекции Beckman
P/ACE 2050
1993 – Первая демонстрация типирования микросателлитных маркеров
с помощью CE (внутренний стандарт – 2 фрагмента и аллельный
лэддер TH01)
1995 – многоцветный генетический анализатор ABI 310 Genetic Analyzer
Методу > 20 лет
Первый анализ STR с помощью CE, 1993
Декабрь 1993
300 bp
150 bp
TH01 allelic
ladder
Одноцветный формат
Butler et al. (1994) BioTechniques 17: 1062-1070
Приборы капиллярного электрофореза
ABI 310
single capillary
ABI 3100,
3130XL
16-capillary array
Преимущества использования
автоматических генетических анализаторов
vs. традиционный электрофорез
1. Автоматизация: внесение образца, электрофорез и детекция
полностью автоматизированы.
2. Высокая скорость анализа
(16 образцов х 10-24 локусов = > 160 маркеров за 30 мин.)
3. Документирование результатов: Результаты автоматически
сохраняются в электронном легко доступном виде.
4. Высокая воспроизводимость результатов изо дня в день (в
стандартных условиях!)
5. Точность определения размера фрагментов > 0.5 п.н. (в
стандартных условиях!)
6. Автоматическая идентификация аллельных вариантов.
7. Cтандартизация
Система капиллярного электрофореза
Капилляр 50 µm
заполненный
линейным
полимером
Аргоновый лазер
488 нм
Капилляр
+
5-20 kV
50-60°С
Буфер
Буфер
Анализ
результатов
Образец
в формамиде
Внесение образца в капилляр (инжекция)
Капилляр
Электрод
Пример: Инжекция 3 кВ - 5 секунд
Количество вносимой ДНК обратно
пропорционально ионной силе
раствора –> HIDI Формамид
-
ДНК
-
Удаление солей позволяет повысить
уровень сигнал.
Образец в
формамиде +
размерный
стандарт
Разделение фрагментов
Капилляры - 50µm, длина 43 см (36 см до детектора)
Пористый матрикс – Поли-диметилакриламид (ПДМА) + 8 M мочевина
+ 5% 2-пирролидон ( Коммерческие полимеры: POP-4, POP-6,POP-7)
Буфер: 100 mM TAPS + 1 mM ЭДТА (pH 8.0)
TAPS (N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane-sulfonic acid) не
меняет pH при изменении температуры
Напряжение: 5-20 kV
N
O
O
O
O
O
N
N
N
O
N
N
Флуоресцентная детекция
5’-меченые праймеры (хранить в темноте!)
При поглощении энергии света
определенной длины волны
происходит возбуждение
флуоресцентной молекулы.
Это состояние нестабильно.
Молекула быстро возвращается в
исходное состояние испуская
энергию в виде света
определенной длины волны.
6FAM (желтый), R6G (оранжевый), TAMRA (красный)
Флуоресцентные красители для праймеров
FAM (Синий)
JOE (Зеленый)
548 нм
520 нм
linker
NH2
+
O
TAMRA (Желтый)
580 нм
605 нм
linker
N
NH-Dye
O
O
Основание
ДНК
ROX (Красный)
Dye
Краситель
Производители используют разные
линкеры
Основание
ДНК
Краситель
Спектры испускания красителей
5-FAM JOE NED
ROX
100
80
60
40
20
0
520
540
Возбуждающий
лазер
(488, 514.5 nm)
560
580 600
620
640
Длина волны (nm)
ABI 310 Filter Set F
Изображение, снимаемое CCD камерой в
16-капиллярном приборе
Виртуальные фильтры
525
500
550
575
600
625
650
675 700 nm
Используемые
HEX
PET ROX
LIZ
красители
FL
TET JOE NED
TMR
FAM
VIC
Стрелками указаны максимумы испускания
красителей
Filter sets определяет какой
регион CCD камеры
активен и какая часть
видимого света будет
регистрироваться
Filter A
Filter C
Filter F
Filter G5
Filter A
Filter C
Filter F
Filter G5
Blue
FL
6FAM
5FAM
6FAM
Green
JOE
TET
JOE
VIC
Yellow
TMR
HEX
NED
NED
Red
CXR
ROX
ROX
PET
Orange
LIZ
Used with These Kits
PowerPlex 16
in-house assays
Profiler Plus
Identifiler
5 x 5 матрикс - ABI 310
До 6 красителей одновременно (до 24 STR маркеров )
From Identifiler User’s Manual
Данные после применения матрикса
Сырые данные с матриксным стандартом
6FAM
VIC
NED
PET
LIZ
Мультиплексная ПЦР – одновременный
анализ нескольких маркеров
Анализ мультиплексной реакции
GeneMapper (Life Technologies)
GeneMarker (…)
Полиморфизмы ДНК выявляемые
фрагментным анализом
1. Микросателлиты – STR (Short Tandem Repeat)
Область повторов
TCAT
2. Однонуклеотидные полиморфизмы - SNP (Single nucleotide
polymorfism)
--------AGACTAGACATT--------------AGATTAGGCATT------3. Инсерции/длеции - InDels
6 п.н.
делеция
X
Y
Анализ микросателитных маркеров (STR).
AnimalType Pig (BioType, Германия)
Размерный стандарт
Размерный стандарт – набор
флуоресцентно меченных
фрагментов известной длины,
стабильной подвижности
В диапазоне 100 – 500 п.н.
зависимость размера от
скорости линейная
Определение относительных размеров
фрагментов ДНК
Метод Local Southern
Аллельная лестница (лэддер)
Стандартный набор аллелей
В природе аллелей больше
AnimalType Pig (BioType, Германия)
Зачем нужен аллельный лэддер?
Аллельный лэддер
Форез 1
Генотип: 181,37/185,35
Форез 2
Генотип: 179,52/183,40
Большой мультиплекс не всегда эффективно
работает
Деградация -> миниSTR
miniSTR: принцип
Обычнй
праймер
miniSTR
праймер
Область STR -повторов
Обычнй
праймер
miniSTR
праймер
Длиный ПЦР продукт
в составе большого
мультиплекса
~150 п.н. короче
MiniSTR
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 7.2, ©Elsevier Science/Academic Press
Влияние количества ДНК
Оптимум 0.5-1.5 ng при 30 циклах
Relative Fluorescence (RFUs)
DNA Size (bp)
DNA Size (bp)
-A
+A10
ng избыток
матрицы
2 ng
оптимальное
количество
100 pg
5 pg
Избыточное количество ДНК в реакции
Избыточное количество ДНК в
реакции –> перегруз
Матрикс не работает
Повторное внесение ДНК с
уменьшенной инжекцией –>
отсутствие длиных фрагментов
Повтор ПЦР с нормированным
количеством ДНК (1 нг) – полный
профиль
Артефакты ПЦР: Неполное аденилирование
Способы предотвратить неполное
аденилирование:
-A
1. Продолжительный прогрев при 68-72°С
после завершения программы ПЦР (до
1 часа)
+A
2. Контроль количества вносимой ДНК (не
хватает активности полимеразы)
3. «Волшебный хвост» для немеченого
праймера с последовательностью,
промотирующей аденилирование:
5’-G5’- ATA5’- GTTTCT5’- GTGTCTT-
Артефакты ПЦР: Статтеры
1
2
3
5
5’
GATA
GATA
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
5
6
C
TA
T
5’
4
Уровень статтеров зависит от
- размера повтора (ди-, три, тетра, пента)
- числа повторов
- количества циклов
Статтеры
6.3%
6.2%
5.4%
Аллели
Артефакты: DyeBlob
Праймеры
плохо очищены
После очистки
ПЦР-продукта
на колонках
Необходимо требовать от поставщиков
праймеров двойной очистки: ВЭЖХ + ПААГ
Анализ инсерций/делеций
- Большой потенциал
мультиплексности
- Эффективность амплификации
выше чем для микросателлитов ->
высокая чувствиетльность
- Отсутствие артефактов ПЦР
(статтеров)
Анализ однонуклеотидных замен - SNaPshot
Принцип MLPA