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La culture des bactéries
CIVEL / Microbiologie
La culture des bactéries
I. Multiplication des bactéries
Allongement
Bactérie mère
Invagination
Division
2 bactéries filles
La scissiparité
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
méthode des quadrants
2 : Diviser la boîte de petri en 4 quadrants
3 : soulever le couvercle de la boite de Pétri et
déposer l’inoculum (à l’aide de l’oese) sur une
petite surface au point initial.
4 : stériliser l’oese et après refroidissement faire des
stries serrées sur toute la surface des quadrants 1 et 2
5 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries
serrées sur les quadrants 2 et 3.
6 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries
serrées sur les quadrants 3 et 4.
7 : stériliser l’oese et placer la boite (correctement
identifiée) à l’envers (couvercle vers le bas) dans
l’étuve.
2
1
3
4
2
1
3
4
Isolement sur milieux solides,
par la méthode des quadrants
2
3
Colonies isolées
1
Zone riche
4
- Le dépôt est effectué en zone 12, les colonies y sont serrées et
petites.
- La fin de l’isolement se fait en
zone 4 : on retrouve des colonies
isolées
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
Colonie isolée
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
Variantes
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
Ne jamais écrire
sur le couvercle !!
Initiales, N°de poste, référence
de la souche
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
Face
Profil
En milieu solide : méthode par épuisement
Stries
Vue de face
Gélose inclinée
Vue de profil
En milieu solide : méthode par épuisement
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
L’examen macroscopique
En milieu liquide
L’examen macroscopique : En milieu liquide
SURFACE : Voile, Anneau
Importance du trouble +
(bulles ? Homogénéïté, couleur…)
CULOT : Couleur, adhérence
L’examen macroscopique : En milieu liquide
La culture des bactéries
II. Techniques d’étude des caractères culturaux
L’isolement :
Obtention d’une colonie pure
(ensemble de clones bactériens)
En milieu solide : méthode des quadrants
En milieu solide : méthode par épuisement
L’examen macroscopique
En milieu liquide
En milieu solide
L’examen macroscopique : Sur milieu solide
L’étude de colonies
L’examen macroscopique : Sur milieu solide
L’étude de colonies
Taille, forme,
relief, contour,
aspect de la surface,
transillumination,
consistance,
couleur,
présence d’un halo…
Halo opaque
Halo clair
Centre noir
(colonie)
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture
bactérienne et milieux de culture
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.1. Définitions
-Milieux de culture = préparation dans laquelle un microorganisme
peut se multiplier. Il doit donc comporter tous les éléments nutritifs et
les conditions physico-chimiques (pH, T°, concentration en ions…)
nécessaires au développement du germe étudié.
-Ensemencer = c’est introduire un microorganisme dans ou sur un
milieu de culture.
-Culture = c’est le résultat de la multiplication d’un microorganisme.
-Culture pure = milieu ne contenant qu’une seule espèce
bactérienne. (Notion de clone bactérien)
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.2 : composition chimique moyenne sèche d'une bactérie
Éléments
Pourcentage (en masse sèche)
Carbone
50
Oxygène
20
Azote
14
Hydrogène
8
Phosphore
3
Soufre
1
Potassium
1
Sodium
1
Calcium
0,5
Magnésium
0,5
Chlore
0,5
Fer
0,2
divers
0,3
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.3. Composition d’un milieu de culture
- Source de C et N et d’énergie (glucides (C), lipides (C et P),
protides (C et N = peptone)) = elles fournissent de l’énergie et des
matériels cellulaires aux bactéries.
Peptones (muscles, cervelle d'animaux, caséine, gélatine, soja...) :
contient des aa, fact de croissance, ions, glucides !!
- Eléments minéraux = Na+, K+, Cl-, PO42-, Mg2+… Ils ont un rôle
dans l’équilibre physico-chimique (pression osmotique) et les
besoins en minéraux de la bactérie (+ CoEnzyme)
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.3. Composition d’un milieu de culture
-Eau = (solvant indispensable à la vie sur terre) rôle majeur dans les
réactions de solvatation, hydratation, réactions chimiques et
enzymatiques se réalisent majoritairement en milieu aqueux.
-Facteurs de croissance = ils stimulent la croissance et sont
indispensables à certaines bactéries dites exigeantes (éléments que
les bactéries ne savent pas synthétiser).
-Agar = composé présent dans les milieux solides. C’est un
polyoside extrait d’algues japonaise (=gélose) qui à la propriété
d’être liquide à >56°C et solide à 40°C.
(- Autres : indicateur de pH, agents sélectifs…)
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
Exemple : la gélose ordinaire (GO)
Peptones = hydrolysat de
protéines (source d’aa)
5g
source d’A, N, énergie +
facteurs de croissance +
apporte des ions
Extrait de viande =
macération de viande
contenant des protéines,
glucides, vitamines et sels
minéraux.
1g
NaCl
5g
Maintien de
osmotique
Agar
15g
Solidifiant,
colonie
Eau
Qsp 1L
la
support
Solvatation,
permet
les
biochimiques
pression
pour
hydratation,
réactions
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
Exemple : le citrate de Simmons
Citrate de Sodium
1g
Seule source de C
NaCl
5g
Maintien de
osmotique
Sulfate de magnésium
0,2g
Dihydrogenophosphate
1g
Hydrogénophosphate
potassium
Bleu de bromothymol
Agar
Eau
de
1g
0,08g
15g
Qsp 1L
la
pression
Cofacteur enzymatique
Système tampon
(limite les variations de pH)
Indicateur de pH
Solidifiant,
colonie
support
Solvatation,
permet
les
biochimiques
pour
hydratation,
réactions
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux
de culture
Milieux empiriques
Milieux synthétiques
Milieux semi-synthétiques
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux
de culture
Exemple : la gélose ordinaire (GO) – Nature du milieu : Milieu
Empirique
Peptones = hydrolysat
protéines (source d’aa)
de
5g
Extrait
de
viande
=
macération
de
viande
contenant
des
protéines,
glucides, vitamines et sels
minéraux.
1g
NaCl
5g
Maintien de la pression osmotique
Agar
15g
Solidifiant, support pour colonie
Eau
Qsp 1L
source d’A, N, énergie + facteurs de
croissance + apporte des ions
Solvatation, hydratation, permet les
réactions biochimiques
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux
de culture
Exemple : le citrate de Simmons – Nature du milieu : Milieu
synthétique
Citrate de Sodium
1g
Seule source de C
NaCl
5g
Maintien de la pression osmotique
Sulfate de magnésium
0,2g
Dihydrogenophosphate
1g
Hydrogénophosphate
potassium
Bleu de bromothymol
de
1g
0,08g
Agar
15g
Eau
Qsp 1L
Cofacteur enzymatique
Système tampon
(limite les variations de pH)
Indicateur de pH
Solidifiant, support pour colonie
Solvatation, hydratation, permet
les réactions biochimiques
La culture des bactéries
III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture
III.4. Caractéristiques physico-chimiques
- pH = voisin de la neutralité (7 < pH < 7,5).
RQ : certaines bactéries peuvent soit alcaliniser soit acidifier le
milieu au cours de leur croissance ce qui peut finir par entraver leur
multiplication. On a donc recours à des systèmes tampons pour
limiter les écarts de pH (Ex : système KH2PO4 et K2HPO4)
+ Conditions d’incubation :
- T°C = elle doit être choisie en fonction du germe étudié (en
général 37°C)
- atmosphère = présence ou absence d’O2…
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux
de culture
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
IV.1. Conditionnement
- Les milieux liquides = on parle de bouillon de culture.
- Les milieux solides = on parle de gélose. Ils peuvent être
conditionnés en boite de Pétri ou en tube (gélose inclinée) / agaragar
Isolement : Macroscopie / vérification de pureté
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
IV.2. Classification
421. Selon la composition
- Milieux empiriques = composition non connue exactement (extrait
de viande…)
- Milieux synthétiques = composition qualitative et quantitative
exactement connue.
- Milieux semi-synthétiques = la base est empirique et on additionne
une molécule connue.
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
IV.2. Classification
422. Selon l’utilisation
- Milieux de conservation = milieu en général très pauvre
- Milieux d’identification = milieux servant à identifier le germe (un
caractère)
- Milieux d’isolement = milieux servant à séparer les bactéries
contenues dans un échantillon polymicrobien pour pouvoir, par la
suite, les étudier séparément.
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux de culture
IV.2. Classification
On distingue :
a) les milieux d’isolement non sélectifs : permettent la
culture de la plupart des bactéries.
(GO, GTS, BCP…)
Milieux usuel ou ordinaire : pour les microorganismes non exigeant
(peptones, glucide, ions, eau)
Milieux enrichis : addition de vitamines, sang...
b) les milieux sélectifs = contiennent un inhibiteur ou de
conditions de culture défavorable qui empêche la culture des germes
sauf celui qu’on étudie.
Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs
Agents
sélectifs
nature
Cristal violet
Colorants
Desoxycholate
Dérivé des sels
biliaires
Bile
Azide (de
Sodium)
?
Ex de
milieux
Bactéries inhibées
Drigalski
Bactéries Gram
positif
BEA
Bactéries Gram
négatif (et certaines
Gram positif)
Drigalski
BEA
Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs
Agents
sélectifs
nature
Cristal violet
Colorants
Desoxycholate
Dérivé des sels
biliaires
Bile
Azide (de
Sodium)
?
Acide
nalidixique +
colimycine
Antibiotiques
NaCl à 75g/L
Cétrimide
Sel
Antiseptique
Ex de
milieux
Bactéries inhibées
Drigalski
Bactéries Gram
positif
BEA
Bactéries Gram
négatif (et certaines
Gram positif)
GS +
ANC
Bactéries à Gram
négatif
Chapman
Gram- et certains
Gram +
(Enterococcus et
Streptococcus)
Gélose au
Cétrimide
Toutes bactéries
sauf les
Pseudomonas (et
quelques exeptions)
Drigalski
BEA
Chapman
Les milieux sélectifs : Présence d’ose et d’indicateur de pH
La culture des bactéries
IV. Les différents types de milieux
de culture
Milieux empiriques
Milieux synthétiques
Milieux semi-synthétiques
Milieux de conservation
Milieux d’identification
Milieux d’isolement non sélectifs
Milieux d’isolement sélectifs
Milieux d’enrichissement
La culture des bactéries
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