Transcript 20100909高分辨熔解曲解分析系统（HiResMelting）

SNP及突变研究的最新工具：
高分辨溶解曲线
突变检测和基因分型系统
High Resolution Melting (HRM)
思博全科技有限公司
李满华
Sep 8, 2010
LightScanner 高分辨溶解曲线分析系统
主要用于
1、未知基因突变扫描（Mutation Discovery-Scanning）
20000个SNP/8小时
2、已知基因突变基因型分析（Genotyping）
1)
非标记探针法（Unlabeled Probe)
2)
扩增小片段法（Small Amplicon）
3)
标记探针法（Labeled Probe)
3、Sequence matching
HRM分析流程
在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料
•
时间大约2小时（包含试剂准备）
在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析
•
大约需要5-10 分钟
数据分析和处理
•
大约需要5-10 分钟
PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如
需要）
•
大约需要30-60分钟
LightScanner适于SNP分析
1.
速度、通量—LightScanner 5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测
， 20000个SNP/天
2.
可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping
3.
检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7% （<400bp）
4.
重复性—LightScanner重复性100%
5.
费用—LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB
6.
操作—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
LC Green plus高分辨溶解曲线专用荧光染料
LC Green plus高分辨溶解曲线荧光染料
普通双链DNA结合染料
LightScanner 突变检测原理
------高分辨溶解曲线法是基于杂合异源双链进行突变检测的方法
杂合子
纯合子
PCR
PCR
高分辨溶解曲线结果
双杂合
纯合子
杂合突变
进行高分辨熔解曲线分析的必备条件
•
高分辨dsDNA 饱和荧光染料
• LCGreen Plus, designed specifically for detection of
heteroduplexes formed during PCR, manufactured exclusively
by Idaho Technology
•
具有高分辨温度控制及数据采集本领的仪器
• LightScanner 专门针对High Resolution Melting专利方法而设计
的高分辨熔解曲线分析仪
•
软件
• LightScanner 软件具有进行未知基因突变扫描和针对已知位点进
行基因分型的功能，有Small Amplicon基因分型的内标矫正
LC Green plus高分辨溶解曲线专用荧光染料
LC Green plus高分辨溶解曲线荧光染料
普通双链DNA结合染料
LCGreen® Plus 高分辨溶解曲线专用染料和普通染料结果对比
• 使用传统的荧光定量PCR染料（如SYBR Green）无法检测到杂
合异源双链的存在，因此不能用于进行SNP检测
50
50
45
45
LCGreen Plus
-dF/dT
40
SYBR® Green I
40
35
35
30
30
Heteroduplexes
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
72
74
76
78
80
82
Temperature (°C)
84
86
72
74
wild type
76
78
80
82
84
heterozygote
86
LightScanner高分辨
溶解曲线应用
JASON T. MCKINNEY
SCIENTIFIC PROJECTS MANAGER
LIFE SCIENCES DIVISION
IDAHO TECHNOLOGY, INC.
LightScanner高分辨溶解曲线应用
未知SNP扫描
LunaProbes
非标记探针基因分型
Small Amplicon小片段
基因分型
未知SNP扫描
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
7
7
9
10
10
10
11
11
11
11
11
11
12
12
13
13
14a
14b
17b
17b
19
19
20
21
394delTT/+
2084
G85E/621+1G>T
NA 11282
P67L/3659delC
2421
G551D/R117H
4791
621+1G>T/+
6176
R117H homozygote
14621
I148T/+
15133
R117H/+
16898
1717-1G>A/E193X
1407
711+1G>T/+
8869
deltaF508/1078delT
1718
deltaF508/R347P
7842
deltaF508/A455E
1971
deltaF508/Q493X
2664
deltaF508 homozygote 16553
deltaF508/+
16852
R560T/+
2534
G551D/+
7664
1717-1G>A/+
7777
R553X/+
9145
G542X/+
11967
S549N/+
13278
Y563N/W846X
2712
deltaF508/1898+1G>A NA 18800
2183AA>G homozygote 6989
2183AA>G carrier
12091
Y563N/W846X
2712
W1282X/2789+5G>A
11979
M1101K heterozygote 2545
M1101K homozygote 10752
P67L/3659delC
2421
R1162X/deltaF508
5773
W1282X/+
14007
N1303K/+
10321
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Exon 7
Exon 9
Exon 11
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
7
7
9
10
10
10
11
11
11
11
11
11
12
12
13
13
14a
14b
17b
17b
19
19
20
21
394delTT/+
2084
G85E/621+1G>T
NA 11282
P67L/3659delC
2421
G551D/R117H
4791
621+1G>T/+
6176
R117H homozygote
14621
I148T/+
15133
R117H/+
16898
1717-1G>A/E193X
1407
711+1G>T/+
8869
deltaF508/1078delT
1718
deltaF508/R347P
7842
deltaF508/A455E
1971
deltaF508/Q493X
2664
deltaF508 homozygote 16553
deltaF508/+
16852
R560T/+
2534
G551D/+
7664
1717-1G>A/+
7777
R553X/+
9145
G542X/+
11967
S549N/+
13278
Y563N/W846X
2712
deltaF508/1898+1G>A NA 18800
2183AA>G homozygote 6989
2183AA>G carrier
12091
Y563N/W846X
2712
W1282X/2789+5G>A
11979
M1101K heterozygote 2545
M1101K homozygote 10752
P67L/3659delC
2421
R1162X/deltaF508
5773
W1282X/+
14007
N1303K/+
10321
Exon 13-2
Exon 14a
Exon 14b
Exon 17b-2
Exon 19
Exon 20
非标记探针（LunaProbe）
基因分型
HRM – Lunaprobe 基因分型原理
HRM –
Lunaprobe
基因分型原理
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1
C:T, G:A
Class 2 C:A,
G:T
Class 3 C:G
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Genotype + Scan - Multiplex
Probe Genotypes – Known SNPs
Amplicon Scanning – 发现新的突变
小片段法（SMALL
AMPLICONS）基因分型
Small Amplicon Genotyping
•
适合的PCR片段大小：45-100 bp
•
根据PCR产物的Tm值和峰型进行基因分型
•
实验设计简单
•
需要内标温度矫正
– 使用已知Tm值的双链DNA做温度内标
– 内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正
– 低温内标Tm(~61o) ,高温内标Tm (~92o)
– PCR片段的Tm值范围： 70-88o
•
优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型
Small Amplicon Genotyping
扩增小片段直接进行基因型鉴定
该数据来源于某用户
实验
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon 也可以同时进行多个位点的基因分型
Seipp, M., et al. Quadruplex Genotyping of F5, F2, and MTHFR Variants in a single closed tube by
High Resolution Melting. Clin Chem. 54:1, pgs 1-8. 2008.
Thrombophilia Quadruplex
Seipp, M., et al. Quadruplex Genotyping of F5, F2, and MTHFR Variants in a single closed tube by
High Resolution Melting. Clin Chem. 54:1, pgs 1-8. 2008.
NEW APPLICATIONS
USING HRM
MAAB
• Mutant Allele Amplification Bias
– LunaProbe “blocks” amplification of wildtype allele
• Use LunaProbe to retard amplification of WT
allele during PCR
• PCR anneal temperature LESS than WT probe Tm
but GREATER than Mutant probe Tm
Application – Malaria P.falciparum CRT gene
• LunaProbe assay, 170 bp amplicon
• Must distinguish WT (3D7) from drug
resistant mutant strains
• Must differentiate between mutants
• Need low mutant detection sensitivity
– Down to 1% mutant
• 5 mutations under probe
– GTGTAWGTGTAATKRAWAMAATTT
Lunaprobe Sensitivity – No MAAB
3D7 (WT) = Blue
Sensitivity ~5-10% (Blue and Red)
MAAB on a thermal block (SLOW Tm ramp)
MAAB on LightScanner 32 (FAST Tm ramp)
Effect of Anneal Temp on MAAB
70o
68o
66o
Effect of Anneal Temp on MAAB
64o
62o
60o
MAAB on LS32 – mutant dilutions
Able to
Detect <1%
of Mutant
Allele
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谢谢大家！