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MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE
L ’EXPRESSION DES GÉNES : LA
TRANSCRIPTION DU DNA
I- INTRODUCTION - DÉFINITION
Rappel : définition moléculaire du gène
Expression moléculaire du gène
5’
Transcription
Clase II
A
B
mRNA
rRNA
C
3’
tRNA
Traduction
Protéine fonctionnelle
Définition de la transcription
Segment de DNA (gène)
Brin de RNA (séquence complémentaire du DNA : T
U)
Réplication (DNA copié entièrement)≠ Transcription (copie d ’un fragment)
Régulation de la transcription : présence sur l ’ADN de séquences régulatrices (cible thérapeutique ++)
Transcrit primaire
RNA mature (cellules eucaryotes )
Modifications post-transcriptionnelles
Hybride
RNA-DNA
refroidissement
Concept d ’ARN messager (F. Jacob et J. Monod 1961)
ADN
protéines
100°
+
ARNm
ARNm
DNA db (T2)
ribosomes
mRNA (P32)
Hybridation moléculaire
G-C
A-U
II- Mécanisme général de la transcription
1- Réaction de biosynthèse de l ’ARN
RNA (n) résidus + ribonucléotides triphosphate
RNA (n+1) résidus + PPi
Pyrophosphatase
RNA polymérase DNA
- matrice
dépendante
2 Pi
- précurseurs (ATP, GTP, CTP, UTP)
C 3’
- Mg 2+
C
h
R
h
a
a
PPi
î
base
î
base
n
n
e
3’
- RNA
e
O
polymérase
m
m
a
g ß a
a
base
t
t
r
5’
r
base
i
i
c
O
c
e 5’
RNA produit
e
DNA matriciel
Complémentarité des bases
Ex : phage f X 174
DNA matriciel
A
25
T
33
G 24
C 18
RNA produit
U
25
A
32
C
23
G
20
RNA
Brin matrice : brin -
DNA
Brin non matrice : brin
codant = brin +
RNA polymérase DNA dépendante
Chez E.coli (390 000 Da)
Association transitoire
Cœur de l ’enzyme
ß
ß’
w a
s70
a
Cellules eucaryotes
RNA polymérase I (Pol I) : r RNA
RNA polymérase II (Pol II) : m RNA
RNA polymérase III (Pol III) : t RNA
2 - Déroulement de la transcription
initiation
RNA polymérase
s70
5’
3’
-1
+1
3’
5’
Synthèse du RNA
promoteur
DNA db
Promoteur de procaryotes
- 35
5’
-10
TTGACA
+1
TATAAT
Départ du RNA
3’
Boite de Pribnow (séquences consensus)
RNA polymérase
Promoteur d ’eucaryotes
- 110
5’
- 40
GGCCAATCT
Boîte CCAAT
CGGCGG
- 25
+1
TATAAAA
Boîte GC
RNA polymérase + facteurs de
transcription (TFII D)
Départ du RNA
Boîte TATA
3
Identification des promoteurs : techniques d ’empreintes ou “ foot printing ”
DNA marqué avec 32P
Sans protéine
Protéine se fixant sur l ’ADN
Coupure par la DNAse
Coupure par la DNAse
“empreintes”
Électrophorèse sur gel
RNA polymérase
s
promoteur
- 35
5’
3’
- 10
3’
5’
Complexe
fermé
Complexe
ouvert
P-P-P-Pu
RNA naissant
NTP
PPi
s
Élongation
RNA polymérase
Brin codant
Brin matrice
Boucle de transcription
3’
3’
5’
5’
3’
Hybride DNA-RNA
5’
RNA
Direction de la transcription
mRNA
3’
5’
Gène A
3’
5’
mRNA
5’
Gène B
3’
mRNA
3’
5’
Gène C
3’
5’
DNA
terminaison
ARN : CG et UA
Séquences riches en GC et AT sur le DNA matrice
Dissociation de l’ARN pol
Appariement des bases dans l ’ARN
C
U
C
U
G
G
A
C
G
C
C
G
5’
UAAUCCCACA
C
U
G
C
G
G
C
AUUUU(3 ’OH)
Structure en “épingle à cheveux”
Rupture de l ’hybride ADN-ARN
Autre mécanisme : protéine r (activité RNA-DNA hélicase)
III- Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription
1- Maturation des ARN
Modification des extrémités
Extrémité 5 ’ : addition du chapeau “ Cap”
7 méthylguanosine
H
Extrémité 3 ’ : queue poly (A)
ARN nouvellement synthétisé
3’
RNA + n ATP
RNA-(AMP)n + nPPi
Polyadénylate polymérase
Signification biologique ?
Cap : liaison du mRNA au ribosome
Queue Poly A : protection du mRNA
Excision et Epissage
5’
DNA
exon 1
3’
intron A exon 2
intron B
intron A exon 2
intron B
exon 3
3’
5’
transcription
Pré mRNA =
transcrit primaire
exon 1
exon 3
épissage
RNA mature
exon A exon B
exon C
3
E
Parfois épissage alternatif
Ex : gène de l ’ovalbumine
A
1
B
2
C
D
4
5 F6
G
7
7700 pb
transcription
A
1
B
2
C
3
2 3
4
E
5 F6
Épissage, polyadénylation
7 introns
1
D
4
5 6
chapeau
1872 nucléotides
7
AAAA(A)n
G
7
2- Régulation de la transcription
Substances régulatrices (répresseurs et inducteurs)
ADN
transcription
ARN m
Protéine
Chez les procaryotes : l ’opéron (Ex opéron lactose)
promoteur
Gène régulateur
5’
I
3’
P
Gènes de structure
A
O
B
3’
C
5’
Opérateur (+ protéines régulatrices)
Opéron
en l ’absence de substrat à métaboliser (culture dans un milieu sans lactose)
ARN polymérase
5’
3’
I
O
A
B
C
3’
5’
mRNA
répresseur
P
Pas de transcription
3’
5’
En présence du substrat
ARN polymérase
5’
3’
I
P
O
A
B
3’
5’
mRNA
transcription
enzymes
substrat
+
(Inducteur)
répresseur
Complexe
répresseur-inducteur
C
3’
5’
Chez les eucaryotes :
2n
2n
2n
2n
2n
zygote
2n
différenciation
2n
- Cellules musculaires
-coeur
- hépatocytes
- foie
Développement
- cellules osseuses
- squelette
- cellules nerveuses
-cerveau
- cellules épithéliales ...
-peau...
Cellules souches totipotentes
Pluripotentes, multipotentes
Développement embryonnaire
Cellules souches =
Bases de la thérapie cellulaire
2n
2n
Cellules souches
Fonction : spécialisation
Cellules musculaire
Fonction :ex contraction cardiaque
Toutes les cellules d ’un organisme possèdent les mêmes gènes mais diffèrent par leurs protéines (fonctions différentes)
Régulation de l ’expression des gènes
Ex : régulation hormonale de la transcription
Hormone hydrophile
récepteur
Hormone hydrophobe
Protéine porteuse
Membrane
Membrane
Transduction du signal
Molécule intracellulaire
Relai
Récepteur
nucléaire
Facteur de transcription
Complexe
récepteur - hormone
+
protéines
Ex : glucagon
+
protéines
Ex : glucocorticoïdes
Blocage de la transcription par les antibiotiques
Actinomycine D
Rifampicine
Cas de l ’a amanitine (Amanite Phalloïde)