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Les données et les banques de données
Les données
chromosome
Les données
chromosome
gène
position
Les données
gène
chromosome
séquence
Motifs
régulateurs
position
structure
Intron
Codon start
Exon
Codon stop
Les données
gène
chromosome
structure
séquence
Motifs
régulateurs
Quantification
expression
ADNc
ESTs
position
Intron
Codon start
Exon
Codon stop
ARN prémessager
ARN
messager
AAAAA
séquence
Les données
gène
chromosome
structure
séquence
Motifs
régulateurs
Quantification
expression
ADNc
ESTs
position
Intron
Codon start
Exon
Codon stop
ARN prémessager
ARN
messager
AAAAA
séquence
Protéine
séquence
structure fonctions
Les banques de données
La principale mission des banques est de rendre publiques les données
issues du séquençage
Il existe deux types de banques de données :
banques généralistes : collecte de données la plus exhaustive possible
banques spécialisées : établies autour d’une thématique principale
Les banques de données généralistes
Les banques de séquences nucléiques
les séquences nucléiques peuvent être de plusieurs natures :
ADN génomique, ADNc ...
EMBL pour European Moleculary Biology Library
créée et financée en 1980 parl ’EMBO diffusée
actuellement par l ’EBI (Angleterre)
GENBANK
créée en 1982 par la société IntelliGenetics et
diffusée actuellement par le NCBI (USA)
DDBJ pour DNA Data Bank of Japan
Créée en 1986 par le NIG Japon
Echanges systématiques des données depuis 1987
Mise en place d’un système de conventions communes
Les banques de données généralistes (2)
Les banques de séquences protéiques
une protéine peut être obtenue de deux manières différentes :
1. in silico : déduite de la séquence nucléique par simple traduction
2. isolée à partir de la cellule et séquencée
PIR-NBRF
créée en 1984 par la NBRF
SWISSPROT
créée en 1986 à l ’université de Genève
maintenue depuis 1987 entre cette université et l ’EBI
Les défauts des banques de données
1. Principal défaut :
le manque de vérification des données soumises
2. Hétérogénéité dans la nature de séquences
on trouve : ADN nucléaire, ADN mitochondrial, ADN chloroplastique,
ARN messager, ARN de transfert, chromosomes entiers…
3. Variabilité de l’état des connaissances sur les séquences
travail expérimental ou prédiction bioinformatique
4. Erreurs dans les séquences
5. Biais d’échantillonnage
toutes les espèces ne sont pas représentées
tous les gènes d ’une espèces ne sont pas présents
il existe une redondance des données
Les banques spécialisées
Devant la croissance exponentielle et l’hétérogénéité des séquences
des banques spécialisées se sont constituées autour de thématiques
biologiques particulières.
Exemple : les motifs spécifiques d ’une séquence nucléique ou protéique
sites ayant une activité biologique ( TATAbox, site de fixation de l ’ATP)
Les bases de motifs nucléiques (éléments régulateurs …)
TRANSFAC (1993), TFD (1994)
Les bases de motifs protéiques
PROSITE (1993), BLOCK (1991)
Toutes ces données représentent un espace de connaissances de
références à partir desquelles on tentera d ’identifier les séquences
des gènes inconnus, issues du séquençage.
Manipulation des données
Les séquences sont stockées en général sous forme de fichiers texte qui
peuvent être soit des fichiers personnels, soit des fichiers publics
accessibles par des programmes interfaces (SRS, GCG, Acnuc).
Le format correspond à l'ensemble des règles (contraintes) de présentation
auxquelles sont soumises la ou les séquences dans un fichier donné.
Ainsi, le format permet donc :
> une mise en forme automatisée,
> le stockage homogène de l'information,
> le traitement informatique ultérieur de l'information.
Pour lire et traiter les séquences, les logiciels d'analyse
autorisent un ou plusieurs formats des données.
Partie I du TD
Annotations des séquences
L’annotation
Séquences
Annotation structurale
• localisation des gènes
• structure des gènes
• régions codantes
• positions des motifs régulateurs
Annotation fonctionnelle
• fonction biochimique
•fonctions biologiques
•régulation et intéractions
•expression
informations biologiques
Expérimentations humides
Prédictions in silico
Détection de gènes eucaryotes ab initio
La recherche de gène dans le génome d'espèce eucaryote est complexe :
1. les régions codantes sont morcelées par la présence d'introns
2. les régions codantes représentent moins de 5% du génome
eucaryote.
La prédiction des gènes de génome eucaryote peut être appréhendée
selon trois approches:
1. basée sur la similarité de séquence
2. ab initio
3. génomique comparative
Similarité de séquence
Pour la recherche des gènes, elle peut être utilisée selon trois voies :
- comparaison directe de la séquence génomique avec des ESTs
détermination des séquences codantes et des limites intron/exon
- comparaison des six cadres de lecture de la séquence contre des protéines.
- comparaison entre les différentes traductions de la séquence génomique et
celles de banque de données génomiques et d’ADNc.
similarité de séquence : méthode puissante mais non infaillible
Comparaison de séquences
Séquence brute : à quoi elle correspond ?
actcttctggtccccacagactcagagagaacccaccatggtgctgtctcctgccgacaagaccaacgtcaaggccgcctggggtaaggt
cggcgcgcacgctggcgagtatggtgcggaggccctggagaggatgttcctgtccttccccaccaccaagacctacttcccgcacttcga
cctgagccacggctctgcccaggttaagggccacggcaagaaggtggccgacgcgctgaccaacgccgtggcgcacgtggacgacatgcc
caacgcgctgtccgccctgagcgacctgcacgcgcacaagcttcgggtggacccggtcaacttcaagctcctaagccactgcctgctggt
gaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgac
ctccaaataccgttaagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgta
cccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc
1. Ressemblance avec d’autres séquences déjà connues?
2. Trouver toutes les séquences d’une même famille
3. Rechercher toutes les séquences qui contiennent un motif donné
Dot Plot
Les dot plots sont utilisés :
- pour comparer visuellement deux séquences et détecter les régions ayant une
forte similarité
1. Les deux séquences sont placées le long des axes
d ’un graphique.
2. L ’intersection de chaque ligne et colonne est marquée
d ’un point si la lettre est identique dans les deux séquences
Une suite de points sur la diagonale indique :
les régions de similarité entre les deux séquences.
Dot Plot
Avec des séquences réelles, les motifs ne sont pas si évidents !
Alignement de séquences
Objectif : essayer de faire le maximum d ’appariements entre deux séquences
- avoir le plus d’identité entre les séquences X et Y
Lorsque deux séquences sont comparées:
on observe des substitutions
des insertions et des délétions
Exemple 1:
S1 : TCAGACGATTG n=11
S2 : TCGGAGCTG m = 9
alignement 1
identité x
substitution y
Indel z
TCAG-ACG-ATTG
TC-GGA-GC-T-G
7
0
6
alignement 2
TCAGACGATTG
TCGGAGCTG
4
5
2
alignement 3
TCAG ACGATTG
TC GGA GCTG
6
2
4
Quel est le meilleur alignement ?
Ce qu’on veut, c’est le maximum de bases identiques et
le minimum de substitutions et indels
donc
1. On va pénaliser les substitutions et les insertions/délétions (w)
2. On va rechercher un coût minimal pour l’alignement
coût = w substitution * y + w indel * z
pour les alignements précédents :
si w substitution = 1 et w indel = 2
alignement 1
Coût = 1 *0 + 6*2 = 12
alignement 2
Coût = 1*5 + 2*2 = 9 <- alignement qui a le moins de coût : c’ est le meilleur
alignement 3
Coût = 1*2 + 2*4 = 10
Recherche de similarité globale ou locale
Les finalités de ces deux types de recherche sont très différentes.
L'alignement global (Needelman & Wunch) :
comparer des séquences homologues (apparentées) sur toute
leur longueur.
L'alignement local (Smith & Waterman, BLAST, FASTA) est conçu
rechercher dans la séquence A des régions semblables à la
séquence B
Les matrices de substitution
Pour aligner deux séquences,
il faut évaluer leur similarité en attribuant un score grâce à des matrices de scores.
On distingue deux types de scores:
- le score élémentaire qui est la valeur donnée directement dans la matrice
- le score global qui est calculé comme la somme des scores élémentaires
Exemple:
A
T
C
G
A
1
0
0
0
T
0
1
0
0
C
0
0
1
0
G
0
0
0
1
ATGGCTAGAACT
TACGGCTTAGCTA
Score global = 5
Score élémentaire
Exemples de matrices protéiques
1. Les matrices PAM (Point Accepted Mutation) M. Dayhoff années 70
Obtenues par l’étude de 71 familles de protéines (1300 séquences)
Elles donnent les scores de similarité obtenus en fonction du nombre de mutation
pour une séquence de longueur 100 aa.
Ex : PAM1 : 1 mutation entre deux séquences de 100 aa (~= 100 % identité)
les deux séquences sont pratiquement identiques
PAM250 : 250 mutations (~= 20% identité)
2. Les matrices de type BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)
obtenues à partir de motifs conservés entre des familles de protéines
les matrices BLOSUM plus récentes donnent en général de meilleurs résultats
3. Les matrices liées aux caractéristiques physico-chimique
ex: caractère hydrophile ou hydrophobe des protéines
BLOSUM 80
PAM 1
Peu différent
BLOSUM 62
PAM 120
BLOSUM45
PAM 250
très différent
Le logiciel BLAST
Basé sur des méthodes statistiques pour déterminer si la similarité observée
est significative biologiquement
L ’unité fondamentale de BLAST est le HSP (High-scoring Segment Pair)
HSP : région de similitude la plus longue possible entre deux séquences ayant
un score supérieur ou égal à un score seuil
MSP (maximal-scoring Segment Pair) : meilleur score obtenu parmi tous les
HSPs que peuvent produire deux séquences
4 programmes distinct de comparaison d ’une séquence avec les bases de données:
BLASTN : séquence nucléique contre banque nucléique
BLASTP : séquence protéique contre base protéique
BLASTX : séquence nucléique traduite en 6 phases contre base protéique
TBLASTX : séquence nucléique traduite en 6 phases contre base nucléique
traduite sur les 6 phases
L ’algorithme de BLAST
La stratégie de la recherche consiste à :
1. Rechercher tous les mots de longueur W dans la séquence
W=3 pour les protéines
W=11 pour les acides nucléiques
2. Comparer ces mots avec les séquences de la banque afin d’identifier
des régions similaires exactes.
3. Extension du segment trouvé dans les deux directions le long de chaque
séquence à partir du mot commun pour améliorer le score de l ’alignement.
L ’extension s’arrête si:
le score descend d ’une quantité x donnée par rapport à la valeur max
qu ’il avait atteint
le score devient inférieur ou égale à 0
la fin des deux séquences est atteinte
blast
Résultats de BLAST
La signification des alignements est évaluée statistiquement en fonction de :
la séquence : longueur et composition
la banque de données : taille
la matrice utilisée
Il appartient au biologiste de déterminer si ces alignements sont significatifs
biologiquement ou non.
Options du logiciel BLAST
WORLDLENGTH (w) :
W correspond au nb de lettres que contiennent les fragments initiaux
W=3 pour les protéines et 11 pour les acides nucléiques.
Pour augmenter la sensibilité, on peut diminuer la valeur de W
mais cela augmente le temps de calcul.
FILTER :
Cette option, activée par défaut, permet de masquer certaines régions
de faible complexité
MATRIX :
Cette option autorise l ’utilisateur à modifier la matrice utilisée
EXPECT :
Cette option permet de modifier le score seuil pour la recherche
Seuls les alignements dont le score est inférieur à E seront reportés.
Plus la valeur de E est faible, plus les résultats obtenus sont pertinents.
Détection in silico
Méthode basée sur des règles consensus concernant :
- la détection de signaux de transcription
de traduction
d’épissage …
Elle permet de détecter de nouveaux gènes, ne ressemblant à
aucune séquence ou domaine connu.
Prédiction de gènes eucaryotes
Les éléments à rechercher sont les suivants:
1. la région promotrice :
TATA-box localisée 30 nt en amont du +1 de la transcription
motif de Kosac localisé juste en aval du codon ATG initiateur
ilots CpG , région riche en dinucléotide CG
2. le signal de polyadénilation : hexamère consensus AATAAA
localisé 20 à 30 nt en aval du codon stop
3. les introns
sites donneur, accepteur et le nucléotide de branchement
Jonctions intron/exon
Les erreurs : où et pourquoi ?
Extrémités des gènes sont difficiles à prédire
•
•
•
•
pas ou peu de différence entre les régions intergéniques et les UTR
en 3 ’ signaux de polyadénylation sont parfois rares
en 5 ’ régions promotrices floues
présence d ’exons non codants et d ’introns dans les UTR
conséquences : fusion ou cassure des gènes prédits
Erreurs internes
• alignement épissé n’est pas 100% fiable
(séquences de mauvaises qualité, vecteurs, polyA)
• les petits exons sont mal prédits d ’où erreur de structure
• introns : généralement seuls les sites AG:GT sont recherchés
• présence d ’événements alternatifs (épissage, initiation traduction)
Génomique comparative
Approche phylogénétique basée sur la comparaison de deux
génomes.
=> conservation de séquences importantes biologiquement
gènes,
régions régulatrices
Alignement multiple
consiste à aligner plusieurs séquences dans leur intégralité :
- caractériser des familles de protéines
- identifier les régions conservées entre ces séquences
- déterminer la séquence consensus de plusieurs séquences alignées
trouver, par exemple, un primer consensus pour la PCR …
- constituer le point de départ d’une phylogénie
Inconvénient:
=> L ’alignement multiple retourne toujours un résultat
Ce traitement n’a de sens que si les séquences à aligner
sont supposées proches.
Logiciels d’alignement
Clustal X ou W (ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk)
EXEMPLE FICHIER FORMAT FASTA
>CandidaAlbicans
SPGRVNLIGDHIDYNFFPWANYFKCALGMKLTFDGNVPTGGG
>CandidaParapsilosis
SPGRVNLIGDHIDYNYFPWANYFKCGLGMNITFSGTVPTGGGL
>YeastGAL1
SPGRVNLIGEHIDYCDFSWSNYFKCGLGLQVFCEGDVPTGSGL
Autres types d’annotations possibles
Annotation des promoteurs
Pol II
CREB
TGACGCA
C-myc
sp1
CACGTG
GGGCGG
+1 transcription
TATA
-25 bp
exon
intron
Motifs de fixation des facteurs de transcription sont souvent petits et dégénérés :
beaucoup de faux positifs
Site d ’initiation de la transcription, n ’est jamais formellement identifié
Pas toujours d ’ilots CpG ou de boîte TATA
exon
Les gènes non codants
Que sont-ils?
Gènes produisant des ARN dont la fonction n'est pas de coder pour une protéine.
Ces gènes sont transcrits, mais pas traduits.
Les ARNt. Potentiellement 64 différents, en pratique une quarantaine dans les génomes microbiens
Probablement beaucoup plus dans les génomes de mammifères.
Les ARNr: 5S, 16S, 23S pour les procaryotes, 5.5S, 18S et 28S pour les eucaryotes.
Les ARNsn (small nuclear RNA) éléments du spliceosome.
Les ARNsno , guides de méthylation.