Transcript Contrôle de la prolifération

Cancérogenèse chimique
Introduction
1 bases moléculaires et cellulaires de la cancérogenèse chimique
1-1 le cycle cellulaire
1-2 l’ADN et les lésions de l’ADN
1-3 cancérogène génotoxique et cancérogène non génotoxique
1-4 cancérogène et procancérogène
2 les tests à court terme
2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques
2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique
2-3 pertinence des tests à court terme
3 cancérogenèse
3-1 choix de la dose, procédure
3-2 pertinence et limite
conclusion
Contrôle de la prolifération
Facteur de croissance
ex: EGF; TGF-a
Récepteur
ex: erb
Second messager
ex: ras
Transduction
ex: raf
Promoteur
ex: myc, jun
Mort
apoptose
multiplication
prolifération
Contrôle du cycle cellulaire
cycline D
cycline E
cycline A
cycline B
G0
S
F+
+
P
P
RB
G2
P
G1
P
signaux
M
Contrôle du cycle cellulaire
cycline D
cycline E
cycline A
cycline B
G0
S
F+
P21
RB
G2
G1
P53
M
Télomères et télomérase : âge de la cellule
Extrémités des chromosomes
(TTAGGG)n : 5 – 15 kbases
Télomérase = télomère reverse transcriptase
ARN : matrice
Cycle cellulaire : diminution  mort de la cellule
ADN = molécule chimique
O
O
O
P
O
N
N
H2
C
O
O
O
O P O
O
oxydation
adduit
hydrolyse
H
N
N
NH2
guanine
O
H2
C
N
O
N
O
thymine
Lésions de l ’ADN
Oxydation
Elimination d ’une base (site AP)
Dimères
Fixation covalente
alkylation, arylation, amination...
adduits
monovalent
divalent (pontage)
intrabrin
interbrin
intercalant
Cassures
simple brin
double brin
Lésions de l ’ADN
Mort
nécrose/apoptose
Réparation
réversion
REB
REN
mésappariement
Ku/DNA PK
recombinaison...
Tolérance
mutation génique
mutation chromosomique
Exemple de système de réparation : BER et NER
Excision de bases
Excision de nucléotides
1 – reconnaissance de la lésion / distorsion
2 – incision, excision
3 - resynthèse exacte
Xeroderma pigmentosum : système de réparation de l’ADN déficient
Peau non protégée des UV  tumeurs
Tolérance de la lésion : mutation génique
Oxydation (8 oxo guanine)
CAC C G TA
GTG G CAT
C A C C G* T A
réplication
GTG GA AT
réplication
CAC C TTA
Mutation par substitution
G T G G AA T
Transition : A
G;T
Transversion :
A
A
C
T
C
Mutations géniques par décalage du cadre de lecture
GG
-GG GGG-CC CCC-
-GGGGGGG-CCCCCCCréplication
Perte de deux bases
Décalage du cadre de lecture (frameshift – 2)
Mutations chromosomiques
- Structure des chromosomes :
chromosomes circulaires
fusion de morceau de chromosome
…
clastogène : agent physique ou chimique capable de casser les chromosomes
- Nombre des chromosomes
aneuploïdie : 2n +/- x chromosomes
polyploïdie : n, 3n, 4n … chromosomes
Caryotype après
traitement en fausses
couleurs
Cellule tumorale (polyploïdie)
Cellule normale
Cancérogène génotoxique
Composé (molécule mère ou métabolite) dont l’activité biologique primaire
est l’altération de l’information codée par l’ADN.
Mutation qui se traduit par :
Activation d’oncogènes
Inactivation d’anti-oncogènes
Cancérogène non génotoxique (épigénétique)
Non organe spécifique : interagit avec les protéines de proliférations des
cellules (en activant les protéines codées par des oncogènes ou en inhibant
les protéines codées par des anti-oncogènes).
responsable d’une inflammation : facteurs de
prolifération et production de radicaux libres (ex : ROS = reactive oxygen
species).
Organe spécifique :
hormones :
œstrogène et cancer du sein, testostérone et cancer de la
prostate.
TSH et thyroïdes.
Génotoxique / non génotoxique
1970 - 1978 : cancérogènes = mutagènes
1978 - 1985 : il y a quelques exceptions
1985 - 1990 : exceptions de plus en plus
nombreuse
autre mécanisme ?
1994 : génotoxique / non génotoxique
Détection, évaluation ??
Composé progénotoxique : bioactivation indispensable
O
HO
OH
N d ’une guanine
G
O
HO
HO
HO
OH
OH
Cancérogenèse chimique : plusieurs étapes
Progression
perte p53
Cellules
épithéliales
Cellules
initiées
Papillome
bénin
Promotion
Initiation
Mutation H-ras Sur-expression
cycline D1
Carcinome
squameux
Progression
E-cadherine
TGF-b
Carcinome spinocellulaire
1 - Initiation (irréversible)
2 - Promotion (réversible)
3 - Progression (irréversible)
métastases
Plusieurs étapes et plusieurs clones de cellules :
mutation
Facteurs de
croissance
mutation
+/- facteurs de
croissance
probabilité : facteurs risques
irréversible  multiplication
Bilan première partie :
- Cancérigènes génotoxiques : lésions tolérées – mutation –
oncogène activé / anti-oncogène inactivé
Cancérigènes non génotoxiques (épigénétiques) : stimule la
prolifération, inhibe l’apoptose, inhibe communication
entre les cellules
- Cancérogenèse : molécule mère et/ou métabolites
- Cancérogenèse : plusieurs étapes, phénomènes
irréversibles et réversibles
2 les tests à court terme
2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques
2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique
2-3 pertinence des tests à court terme
Marqueurs à court terme de génotoxicité
Mort
apoptose (cassure de l’ADN)
nécrose
Lésions
oxydation
perte de bases
dimère
fixation
intercalant
cassures
Réparation
réversion
REB
REN
mésappariement
….
Mutations
génique
chromosomique
Essai comète :
Faux positifs : apoptose
Micronoyaux:
fémur
1 000 cellules (bruit de fond : 0,5%)
1 à 2 cycles pour réponse optimale
Faux positifs : apoptose
Synthèse non programmée ADN (UDS)
Réparation par excision de nucléotides
1 – culture de cellules / produit à tester
2 – éventuellement lésions de l’ADN réparées par NER
3 – étape resynthèse en présence de nucléotides radio-marqués
Autoradiographie sur cellules :
taches / radioactivité
UDS :
Réplication
Réparation
ADN
Test de Ames (Mutatest)
Bactérie + produit
+/- S9
Sans S9
Avec S9
Témoins:
négatif
positif
Étude des composés non génotoxique :
Facteur de croissance
ex: EGF; TGF-a
test de prolifération
test de phosphorylation
Récepteur
Second messager
ex: ras
Transduction
ex: raf
Promoteur
ex: myc, jun
multiplication
prolifération
Prolifération de péroxysomes
Organites cytoplasmiques
H2O2 oxydase /H2O2 catalase
enzymes oxydation
Produit à tester
Marqueurs d ’une génotoxicité
Batterie:
spécificité
Pertinence:
modèle de la cancérogenèse chimique
relation marqueur / cancer ???
donc : facteur risque (probabilité)
in vitro
automatisable
extrapolation in vivo
biodisponibilité
élimination (t1/2)
dose
bioactivation (système biaisé)
3 cancérogenèse
3-1 choix de la dose, procédure
3-2 pertinence et limite
Essai de cancérogenèse sur 2 ans
Principe :
Produit à tester / animal / longue durée
Marqueur : tumeur
Problème :
Bruit de fond important
Fréquence des tumeurs spontanées
Rongeurs habituellement utilisés en toxicologie
après 2 ans, protégés des cancérogènes:
organe :
souris
B6C3F1
mâle
souris
B6C3F1
femelle
rat
F344
mâle
rat
F344
Femelle
31 %
8%
3%
3%
Surrénales
4%
1%
20%
8%
Thyroïde
1%
2%
10%
9%
Glandes
mammaires
Poumon
0%
2%
2%
26%
17%
7%
2%
1%
foie
Exemple :
détermination de la DT01; chez des souris:
24 000 animaux / groupe
Compromis: MTD
50 animaux / groupe
Extrapolation des résultats
des études de cancérogenèse
Cancérogènes non génotoxiques :
tumeurs
Boite noire
Glycidol :
Bilan : 24 organes avec
des tumeurs
Rats mâles Rats femelles
Limonène :
Rats mâles Rats femelles
Souris mâles souris femelles
Bilan : 1 site (reins)
dans 1 groupe
Souris mâles souris femelles
Cytotoxicité du composé et tumeurs (MTD, 2 ans !)
a2µ-globuline :
protéine synthétisé chez le rat mâle (hépatique)
filtrée / glomurule
partiellement réabsorbée (endocytose)
La fraction réabsorbée se trouve dans les lysosomes où la protéine
est hydrolysée
d-limonène se fixe sur la globuline qui n’est plus hydrolysée, elle
s’accumule et entraîne la libération des enzymes des lysosomes dans
le cytoplasme  nécrose des cellules, inflammation chronique et
développement de tumeurs.
Saccharine : formation de microcristaux dans la vessie, lésions de
l’épithélium, inflammation chronique, prolifération cellulaire,
tumeur
Cancérogenèse sur 2 ans
+
Caractérisation du mécanisme
de la toxicité
Pertinence de l’information
Conclusion :
Estimation du risque cancérogène
Cancérogène génotoxique
irréversible
1 cellule
Mutation transmise
cellules filles
1 clone (1 tumeur)
Aléatoire - probabilité
bilan:
pas de seuil
pas de dose / effet
dose / probabilité
Cancérogène non génotoxique
réversible
dépend de l ’environnement (ex: inflammation,
alimentation riche en AG poly-insaturés…)
bilan: dose/réponse et seuil
Activité du TPA (phorbol ester)
Nombre de papillomes
par souris
15
12
9
6
3
0
10-9
10-8
10-7
10-6
Concentration
M
Estimation du risque cancérogène Agent à tester (100 000 / an)
structure ?
mutation in vitro (Ames) ?
Abandon du composé
cytogénétique ?
micronoyau in vivo ?
mutation in vivo (animaux transgéniques) ?
en fonction des résultats de toxicologie générale
(sensibilité d ’organe)
Essais non génotoxique
prolifération (foie, estomac, peau, poumon…)
peroxysomes hépatiques
thyroïdes
Caractérisation, DSE, …
induction de P450
inflammation
...
Cancérogenèse à long terme (2 ans)
Classification des substances (Europe)
Cancérogènes
- catégorie 1 : substances que l’on sait être cancérogènes pour l’homme. On dispose
de suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet
entre l’exposition de l’homme à de telles substances et l’apparition d’un cancer.
-- catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances cancérogènes
pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte
présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer un
cancer. Cette présomption est généralement fondée sur des études appropriées à
long terme sur l’animal ou d’autres informations appropriées.
-- catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet
cancérogènes possibles mais pour lesquelles les informations disponibles ne
permettent pas une évaluation satisfaisante (preuves insuffisantes). Il existe des
informations issues d’études adéquates sur les animaux mais elles sont insuffisantes
pour classer la substance dans la catégorie 2.
Classification des substances (Europe)
Mutagènes
- catégorie 1 : substances que l’on sait être mutagènes pour l’homme. On dispose de
suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet entre
l’exposition de l’homme à de telles substances et des défauts génétiques héréditaires.
-- catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances mutagènes pour
l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte
présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer des
défauts génétiques héréditaires. Cette présomption est généralement fondée sur des
études appropriées sur l’animal ou d’autres informations appropriées.
-- catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet mutagènes
possibles. Des études appropriées de mutagénicité ont fournies des éléments, mais ils
sont insuffisants pour classer la substance dans la catégorie 2.
Etiquetage - Europe
classement
Symbole
Phrases de Seuil
risque
(1)
Cancérogène catégorie 1
T (toxique)
R 45 ou R 49  0,1%  0,1%
Cancérogène catégorie 2
T (toxique)
R 45 ou R 49  0,1%  0,1%
Cancérogène catégorie 3
Xn (nocif)
R 40
1%
Mutagène catégorie 1
T (toxique)
R 46
 0,1%  0,1%
Mutagène catégorie 1
T (toxique)
R 46
 0,1%  0,1%
Mutagène catégorie 1
Xn (nocif)
R 68
1%
R 40 : effet cancérogène suspecté – preuves insuffisantes
R 45 : peut causer le cancer
R 49 : peut causer le cancer par inhalation
R 46 : peut causer des altérations génétiques héréditaires
R 68 : possibilité d’effets irréversibles
(1) : préparations autres que gazeuses, (2) : préparations gazeuses
Seuil
(2)
1%
1%
Classification du centre internationale de recherche sur le cancer
(CIRC/IARC)
5 catégories:
- groupe 1 : l’agent (ou le mélange) est cancérogène pour l’homme
- groupe 2A : l’agent (ou le mélange) est probablement cancérogène pour
l’homme
- groupe 2B : l’agent (ou le mélange) est un cancérogène possible pour
l’homme
- groupe 3 : l’agent (ou le mélange) ne peut être classé du point de vue de sa
cancérogénicité pour l’homme
- groupe 4 : l’agent (ou le mélange) est probablement non cancérogène pour
l’homme