PCR PV92 Secuencias Alu

Genes divididos en eucariotas • • • • • Gen codifica la proteína Esta secuencia no es corrida de principio a fin La secuencia de ADN en genes eucariotas presenta interrupciones Interrupciones: Intrones Regiones codificantes: Exones

“ Splicing“ • • El transcrito primario es procesado por splicing Elimina los intrones y une los exones • Ejempo: Gen de la distrofina tiene 74 intrones ARNm

ADN repetitivo

• • • Secuencias repetitivas encontradas en todo el genoma Parte del “ADN chatarra” Pueden variar en longitud: ▫ LINEs: miles de pb ▫ SINEs: 200-300pb

SINEs (short interspersed nuclear elements) • • • • • SINE tienen menos de 500pb En un genoma humano se pueden encontrar 500 000 o más. Los SINEs humanos mejor caracterizados: familia Alu (el nombre se debe a la presencia de sitios de restricción para la endonucleasa AluI). Miembros de familia Alu tienen entre 200 y 300pb de longitud y se encuentran dispersos bastante uniformemente por todo el genoma, tanto entre genes como dentro de ellos. En humanos, secuencias Alu son más 5% del genoma completo.

BRCA1

Rojo: exones Flechas: Alu (más del 40% de los intrones) Flechas azules: Alu involucrados en deleciones y duplicaciones (recombinación con otros Alu)

• Lo detectamos por PCR

Herencia mendeliana del polimorfismo de Alu

Electroforesis

• Banda más pesada puede ser más tenue • Cuidado para no hacer errores en asignar genotipo • En heterocigotas se puede formar heteroduplex que migra más lento

Dímeros de primer en PCR

Primer dimers

•Complejos de los dos primers •Más frecuentes cuando reacción no amplificó, también cuando se usa un exceso de primers •Cuidado cuando se corren geles poco tiempo Primer dimer

Importancia de intrones en estudios de variación genética • Proporción importante de la variación genética en los intrones o regiones entre genes. ¿Por qué?

• Importantes en: identificación de individuos y genética de poblaciones

Resolución de problemas de PCR

http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcr troubleshooting-checklist/

Ejercicio • Primers para locus PV92: • Hacer PCR in silico

Ejercicio • Copiar secuencia amplificada • Hacer un BLAST: ▫ Nucleotide BLAST ▫ ▫ Contra base de datos nr/nt Somewhat similar sequences (blastn) • Identificar secuencias similares, ver valores de E

Ejercicio • Analizar secuencias: ▫ Human Alu repeat   ¿Qué observa flanqueando la secuencia Alu?

¿Cómo termina la secuencia Alu?

▫ Homo sapiens isolate BAS101 AluPV92 repeat sequence  ¿Cuál es la relación entre esta secuencia y la anterior?

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