Transcript cuantificar adn

Extracción y Cuantificación
de ADN
Tecnología Básica
Extracción y Cuantificación
Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction)
Separación: Electroforesis
Detección
Análisis
Extracción de ADN: Múltiples maneras!!
EXTRACCION DE ADN




ORGANICA
CHELEX
PAPEL FTA
OTRAS
 Extracciones basadas en estuches
 QIAamp, GeneClean, etc.
 Pueden depender en
 Protocolos de LAB
 Tipo de muestra
Preparación de Muestra
 Extracción de ADN Orgánica
 Extracción por Chelex
 Extracción de ADN utilizando papel
FTA
 Estuches QIAamp para separar ADN
 Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
 PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL
ALCOHOL (PCI)
 PRODUCE ADN DE ALTO PESO
MOLECULAR
 CONSUME MUCHO TIEMPO
 QUIMICOS PELIGROSOS
 MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
EXTRACCION ORGANICA DE
ADN
 COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
 AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
 ROMPE LAS CELULAS (SDS)
 ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
 AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y
lípidos
 Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas
 Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol
 Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
 ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
 RECUPERACION DE ADN
 Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
EXTRACCION POR CHELEX
 1991 Laboratorios Bio-Rad
 RESINA QUELANTE
 REMUEVE MAGNESIO
 (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
 ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
 UTILIZE SOLO CON PCR (cadena
sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX
 AÑADA MUESTRA AL TUBO
 AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
 100°C PARA ROMPER CELULAS
 DESTRUIR PROTEINAS
 ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
 UTILIZE SOBRENADANTE
DIRECTAMENTE EN PCR
EXTRACCION CON PAPEL
FTA™
 PAPEL ALMACENAJE A BASE DE
CELULOSA
 CONTIENE QUIMICOS
 PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
 ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
 UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O
SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnología FTA®
 Rompe células y membranas de
organelos
-Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos
(ADN & ARN)
 Preserva y Proteje Acidos
Nucleicos
-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático
-Inhibe crecimiento de hongos y
bacterias
 Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Viruses
Peligrosos
Preparación de ADN Rápida y Eficiente
FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
Convencional
versus
FTA
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp
ambiente
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -200C
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -200C
Costo
$2,000/congelador/año
Costo
$75/gabinete de
archivo
Archivado a Temperatura Ambiente
Perfil de STR de
sangre archivada en
1989 y analizada en
2003
• Muestras archivadas en
ambientes diferentes,
selladas en sobre de
aluminio
• Proceso normal de
colección de muestra
• 10 µL de reacciones de
Profiler™ añadido a
muestras, 24 ciclos
EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
 Sangre o saliva seca en papel FTA
 Células se ROMPEN al contacto
 UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al
TUBO
 LAVE para remover HEME y otros
inhibidores de PCR
 Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción
de PCR
EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
 CUANTIFICACIÓN NO es necesaria
 Cantidad de muestra consistente
 Resultados consistentes
 Posible AUTOMATIZACIÓN
ORGÁNICA
Papel FTA
CHELEX
SDS, DTT, EDTA
y
Mancha
de
sangre
proteinase K
ENCUBAR (56 oC)
Mancha
de
sangre
Aplicar sangre al
papel y dejar que
se seque
Agua
ROTO
Centrifugar
ENCUBAR (ambiente)
Phenol,
chloroform,
isoamyl alcohol
Centrifugar
REMOVER sobrenadante
VORTEX
Centrifugar
5%
Chelex
TRANSFER aqueous (upper) phase
to new tube
REMOVER sobrenadante
ENCUBAR (56 oC)
TE buffer
CONCENTRAR muestra
(Centricon/Microcon-100 or ethanol
precipitation)
Centrifugar
CUANTIFICAR
ADN
LAVAR Múltiples veces
con buffer de extracción
Reactivos
de PCR
ENCUBAR (100 oC)
Centrifugar
(NO CUANTIFICACIÓN)
CUANTIFICAR
ADN
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
CUANTIFICACIÓN DE ADN
 ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR
 MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS
 DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
 MÉTODOS INICIALES NO MUY
SENSITIVOS O ESPECÍFICOS
 ABSORBENCIA A 260 nm
 TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
 Cuantificación comparada a marcador estándar
Cuantificación por "Slot Blot"
 Procedimiento Común
 Específico para primates
 Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida
 Puede detectar cantidades menores que
nanogramos
 Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla
CUANTIFICACIÓN DE ADN
 CUANTIFICACIÓN POR "SLOT
BLOT"
 ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE
 D17Z1
 RADIOACTIVO
 COLORIMÉTRICO
 QUIMIOLUMINISCENTE
CUANTIFICACIÓN DE ADN
 CAPTURAR ADN GENÓMICO EN
MEMBRANA DE NILÓN
 AÑADIR PRUEBA D17Z1
 INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES
 SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico
Ventajas
Slot Blot
Desventajas
 Puede ser sensitivo
 Reemplaza
radioactividad
 Puede detectar
cadenas sencillas y
ADN parcialmente
degradado.
 Cantidad dada es
sólo de ADN
humano
 Consume tiempo
 Labor intensiva
Estándares de
Calibración
20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng
Muestras
Desconocidas
~2.5 ng
Estándares de
Calibración
0.63 ng
1.25 ng
2.5 ng
5 ng
10 ng
20 ng
Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Fluorometría vs
Espectrofotometría
Fluorometría
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o
PicoGreen
-- aumento en emisión a 458 nm cuando
enlazado a ADN de doble cadena
*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla
o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T
*Muestra es comparada a curva estándar de ADN
cuya concentración es conocida
--utilize estándar con composición similar
para lecturas más precisas
Cuantificación de ADN por
espectrofotometría
 Concentración de ADN puede ser determinada
midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un
espectrofotómetro utilizando una cubeta de
cuarzo
 Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a
50 µg de ADN por ml
A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml
Pureza de ADN: Proporción A260/A280
*Proporción indica pureza/presencia de
contaminantes que pueden absorber luz UV
(proteínas, etc.)
*ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0
--en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)
--imita alta pureza y producción
--aumenta el valor A260
PCR utilizando 'Real
time'
(qPCR)
Continuará!!