Transcript Tema 9- Sistemas de modificación celular

Tema 9.
Sistemas de modificación celular
Introducción
Genes marcadores
Técnicas de introducción de ADN en las células animales en
cultivo
 Transfección
 Métodos químicos
 Métodos físicos
 Establecimiento de líneas de expresión estable

Transducción: vectores virales
 Adenovirus
 Retrovirus y Lentivirus
Métodos de introducción de proteínas
Tema 9- Sistemas de modificación celular
Manipulación del cultivo celular para la modificación
de la expresión y/o función de los genes.
Ácidos nucleicos
 ADN: construcciones con la secuencia codificante
del gen de interés,…
 ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o
antisense)
Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con
proteínas competidoras (dominante negativo)
Anticuerpos: para neutralizar la función de una
proteína
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¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una
célula?
Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una
sustancia tóxica)
Caracterizar la función de la proteína de interés
Conocer la localización subcelular de una proteína
(proteína marcada)
Facilitar el estudio de la regulación de la expresión
de un gen (región reguladora de la expresión del gen
+ gen marcador)
Obtener proteína recombinante procesada
correctamente por células de mamífero
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Condiciones ideales de introducción del ADN
 Eficiencia máxima
 Toxicidad nula
El método y las condiciones óptimos para cada tipo
celular se tienen que establecer empíricamente
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Estrategias de introducción de ADN
Transfección: introducción del gen exógeno por
métodos químicos o físicos
 Vector: plásmido de expresión
Transducción o infección: introducción del gen
exógeno mediante vectores virales
 Vector: material genético del virus
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Transfección: vector
Componentes de un plásmido de expresión de
células de mamífero:
Amplificación
del vector en
bacterias
1. Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y
amplificar el ADN
2. Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar
las bacterias que tienen el plásmido
1. Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV
expresión elevada y constitutiva)
2. Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la
secuencia de ADN de interés)
3. Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero)
4. Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que
han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o
Higromicina).
Expresión del gen en células de
mamífero y selección de clones
estables
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Vector de expresión para células de mamífero
MCS: multi cloning site
Promotor
Seq. de poliadenilación
Promotor
Gen de resistencia
a la neomicina
(selección en céls. mamífero)
Para
amplificación
y selección en
bacterias
Seq. de poliadenilación
http://www.invitrogen.com
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Genes marcadores o “reporter”
Codifican para proteínas de fácil detección
Permiten:
Controlar la eficiencia de entrada del ADN
Estudiar la regulación de la expresión de un gen
Monitorizar la localización subcelular de la proteína
Aplicaciones:
Normalización de los ensayos de expresión
Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter
Optimización de la metodología de introducción del ADN
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Genes “reporter” más comunes
Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)
Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al
antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol
radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía.
Luciferasa (luc)
Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la
oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz
se puede medir con un luminómetro.
-galactosidasa (-gal or lacZ)
Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en
extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto
coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un
precipitado azul en las células que lo expresan.
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Genes “reporter” más comunes
Green fluorescent protein (GFP)
El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más
útil para visualizar las células transfectadas in vivo.
La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria.
La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz
verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún
sustrato o producto.
En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras
especies de medusa, anémonas y corales
Nuevas proteínas fluorescentes disponibles:
AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1.
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Métodos de Transfección
1.
Métodos químicos:
Se mezcla el ADN con moléculas cargadas
positivamente que facilitan la entrada del ADN en la
célula (moléculas portadoras o “carrier”)
2.
Métodos físicos:
Introducción del ADN de forma directa
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Métodos de Transfección
1.
Métodos químicos:

Coprecipitación con fosfato cálcico

DEAE-dextrano

Lípidos catiónicos

Polyethylenimine (PEI)
2.
Métodos físicos:

Electroporación

Microinyección

“Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun”

Magnetofección
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Barreras que tiene que superar el ADN
http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html
La eficiencia de transfección depende de la superación de varias
barreras:
1) adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y
entrada del complejo en la célula (membrana plasmática)
2) liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación
lisosomal
3) translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el
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núcleo
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1. Métodos químicos
Coprecipitación con fosfato cálcico:
precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que
son endocitados por la célula
ADN + CaCl2
Añadir Na2PO4 en tampón
Precipitados de CaPO4 con ADN
endocitosis
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1. Métodos químicos
DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano):
complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se
introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol
Se utiliza solo en transfecciones transitorias.
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1. Métodos químicos
Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se
acomplejan con el ADN y al fusionarse con la
membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través
de endosomas
Este método recibe el nombre de Lipofección
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Protocolo de
Lipofección
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1. Métodos químicos
Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja
toxicidad en determinados tipos celulares
Gen marcador: -galactosidasa
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1. Métodos químicos
PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que
genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan
con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por
endocitosis
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1. Métodos químicos
Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293
PEI
Lípidos catiónicos
Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)
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1. Métodos químicos
Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas
líneas celulares
DNA transfection of
various cell lines,
including CHO-K1,
COS-7, NIH3T3,
HeLa S3, with
CellLine
Transfection
Reagent
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Factores que pueden influir en la eficiencia de
Transfección
Presencia de antibióticos
 El complejo puede interaccionar con el antibiótico
disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad
Presencia de suero
 El suero puede disminuir la eficiencia de transfección
 Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más
tóxico para las células
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2. Métodos físicos
Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al
citoplasma o núcleo de la célula
Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de
micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con
una pistola de helio.
Electroporación: se basa en la generación de un shock
eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana
que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero
también elevada muerte celular
Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para
facilitar la entrada del ADN en las células
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Microinyección
Introducción de soluciones de macromoléculas
mediante capilares finos de vidrio que se manipulan
bajo un microscopio.
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Microinyección
Limitaciones
Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación
especializados)
Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de
tiempo)
Seguimiento individual de cada célula microinyectada
Aplicaciones más corrientes:
Microinyección de células adherentes
en cultivo
Generación de animales transgénicos
(microinyección de ADN en el pronúcleo
masculino del zigoto)
Fecundación in vitro de oocitos
(inyección de esperma en el citoplasma
del oocito)
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Biolistic particle delivery
Método de transfección
mediante bombardeo de las
células con micropartículas
de oro o tungsteno
recubiertas con ADN o ARN.
Helios Gene Gun - BioRad
Aplicaciones:
Recomendado para
células resistentes a otros
métodos y especialmente
para células vegetales
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Electroporación
Introducción de macromoléculas en
las células mediante la exposición a
un pulso eléctrico de elevada
intensidad y corta duración que
provoca la apertura de poros en la
membrana plasmática.
Ventajas:
• Técnica simple, reproducible y de gran eficacia
Desventajas:
• Requiere desenganchar las células del sustrato
• Mucha mortalidad celular
• Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular
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Electroporación
Parámetros:
 Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm)
 Longitud del pulso (de seg a mseg)
Normalmente las condiciones que permiten una mayor
eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre
el 40 y el 60%
En la actualidad existen también sistemas de electroporación
para células adheridas al sustrato y para realizar
electroporaciones in vivo.
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Magnetofección
MATra - Magnet Assisted Transfection
Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de
biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.
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Tipos de transfección
Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un
período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula.
Transfección estable: permite la expresión de la proteína
indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los
clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de
inserción= 1 célula de cada 10000).
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http://www.promega.com/guides/transfxn_guide/transfxn.pdf
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Transfección transitoria vs. Transfección estable
Transfección transitoria
Ventajas
 Elevado nivel de expresión
 Es fácil co-expresar varias proteínas
 Procedimiento fácil y rápido
Inconvenientes
 Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea)
 Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal)
 Requiere gran cantidad de plásmido
Transfección estable
Ventajas
 Población celular homogénea (clonal)
 Producción continua de proteína (teóricamente)
 Almacenamiento de células expresoras del transgen
Inconvenientes
 Integración del transgen al azar en el genoma celular
 Niveles de expresión moderados
 Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas
 Procedimiento laborioso y largo de selección clonal
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Clones estables: procedimiento de obtención
Transfección
2 días
1/10000 céls.
Adición antibiótico
1-2 semanas
Muerte masiva células no estables
2 semanas
Colonias de células estables
1 mes
Se tripsinizan individualemente
Se cultivan y amplifican para
testar y caracterizar la
expresión del gen
2 meses
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Clones estables: selección con antibiótico
Sin selección
Con selección
muerte de células
no expresoras
aparición de
clones
resistentes
crecimiento
de los clones
estables
Cassettes de resistencia:
NEO: Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml)
HYG: Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml)
PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml)
 Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica
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Tema 9.
Sistemas de modificación celular
Introducción
Genes marcadores
Técnicas de introducción de ADN en las células animales en
cultivo
 Transfección
 Métodos químicos
 Métodos físicos
 Establecimiento de líneas de expresión estable

Transducción: vectores virales
 Adenovirus
 Retrovirus y Lentivirus
Métodos de introducción de proteínas
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Transducción: vectores virales
Adenovirus
Retrovirus
Lentivirus
Herpes virus
Adeno-associated virus
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Vectores virales: Adenovirus
Grupo de virus benignos,
baja patogenicidad (ej.
resfriado común)
Genoma: ADN de doble
cadena linear con una
proteína unida
covalentemente al extremo
5’ (TP: terminal protein).
Longitud aprox. 36 kb
Simetria icosahédrica (80100 nm diámetro)
Proteínas de la cápside:
Hexon, penton base, fibra
globular
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Vectores virales: Adenovirus
Ciclo del Adenovirus
Entran mediante la unión (alta afinitat)
a receptores específicos de la célula
diana mediada por el extremo globular
de la fibra
Endocitosis del virus
Sale del endosoma y transloca al
núcleo
El ADN viral entra en el núcleo y
empieza la transcripción
La transcripción, la replicación y el
empaquetado tienen lugar dentro del
núcleo de la célula infectada.
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Vectores virales: Adenovirus
Genoma del Adenovirus
Se transcriben las dos
cadenas de ADN
Transcripción en dos
fases:
Early: E1, E2, E3 i E4
(antes de la replicación
del ADN)
Late: (después de la
replicación del ADN)
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Vectores virales: Adenovirus
Vector Adenoviral
Virus deficientes en la
replicación- deleción de
las regiones E1
(esencial para la
replicación) y E3
(modulación respuesta
immune huésped).
El inserto puede ser de
7 a 8 kb (gene-X)
Empaquetado en una
línea celular que
proporciona los
productos de E1 y E3 en
trans (normalmente
HEK293)
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Vectores virales: Adenovirus
Ventajas
Infectan un amplio rango de células de mamífero
con elevada eficiencia
Infectan tanto células en división como células
que no se replican
Elevados niveles de expresión de la proteína
Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad
(adecuado para terapia génica)
El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no
produce mutagénesis (epicromosómico)
Se pueden utilizar en cultivos en suspensión
(producción de proteína a gran escala)
Sistema homólogo para genes humanos
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Adenovirus
Inconvenientes
Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb)
Expresión transitoria de la proteína
Aplicaciones
Transducción de ADN en células de mamífero
para estudios de funcionalidad de proteínas
Obtención de proteína recombinante por sobreexpresión en células humanas
Terapia génica “in vivo”
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Retrovirus
Oncoretrovirus (retrovirus)
ej. Moloney Murine Leukemia Virus
Sólo infectan células en división
Lentivirus
ej. HIV
Infectan tanto células en división como quiescentes
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Dos copias de ARN de
cadena simple envuelto de
proteína (ssRNA)
Codifica por una
transcriptasa reversa
(RTase: RNA-dependent DNA
polymerase)
Sólo infecta a células en
división
Se integra en el genoma de
la célula
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Ciclo del retrovirus
Infección célula diana
Genoma RNA  copia DNA  transporte al núcleo
Integración del ADN al cromosoma
Transcripción DNA viral  mRNA
Traducción mRNA  gag, pol, env
Formación cápside: empaquetamiento de
mRNAs/RTase
Partículas virales liberadas
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Construcción Vector Retroviral
¿Qué es imprescindible?

5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA)

señal de empaquetamiento
No se necesita:

gag, pol, env
estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada
para la producción de los viriones
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Construcción Vector Retroviral
Genoma retroviral
Promotor
Gag- proteínas estructurales internas de la cápside
Pol- Rtase, integrasa, proteasa
Env- proteínas de la cápside
Vector retroviral
Promotor
Tamaño máximo del inserto  8kb
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Obtención de los Retrovirus
Línea celular empaquetadora
Producción de
los retrovirus
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Vectores virales: Retrovirus
Ventajas:
Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma)
Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios,
peces, aves, mamíferos)
Inconvenientes:
Limitación tamaño inserto ( 8 kb)
Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus
No infecta células que no se repliquen
La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis
insercional
Aplicaciones:
Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión
estable
Terapia génica “ex vivo”
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Lentivirus
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Métodos de transfección de péptidos,
proteínas o anticuerpos
Microinyección
Electroporación
Lípidos catiónicos
 BioPorter® (Genlantis)
 Pro-Ject (Pierce)
“Carriers” de composición desconocida:
 Chariot (Active Motif)
 ProteoJuice  (Novagen)
 TransPass™ P (New England Biolabs)
 BioTrek™ Protein Delivery Reagent (Stratagene)
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Aplicaciones
Estudiar la función de la proteína introducida
Inhibir la actividad de una proteína celular endógena
Analizar la distribución subcelular de la proteína
introducida
Realizar inmunodetección de proteínas en células
vivas
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
BioPORTER Reagent
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www.genetherapysystems.com
Tema 9- Sistemas de modificación celular
Pro-Ject Protein Transfection Reagent
Efficient protein delivery in hours
instead of days.
This is a unique cationic lipid
mixture which, when complexed with
proteins or peptides, allows direct
intracellular delivery of proteins,
peptides, antibodies and other
biologically active molecules. ProJect Protein Complexes attach to
negatively charged cell surfaces and
either can directly fuse with the
membrane and deliver the captured
protein into the cell or be
endocytosed by the cell and then
fuse with the endosome, releasing
the captured protein into the
cytoplasm (Figure 1). Since the
complex formed is noncovalent it
does not interfere with the protein's
biological activity.
http://www.piercenet.com/
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Tema 9- Sistemas de modificación celular
Chariot™
simple, efficient protein delivery
Chariot™* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports
biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical
delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be
assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing.
This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory
proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives
& transient complementation.
The Chariot™ Advantage
•Works in a variety of cell lines
•Facilitates functional studies in living cells — no fixing required
•Works in vivo (1)
•Fast and efficient — 60-95% transfection in less than 2 hours
•No need for expression of fusion proteins
•Non-cytotoxic, serum independent
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