1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Evgeniy Zavoisky

Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR)

CuCl 2 ·2H 2 O

Premios Nobel y resonancia

• • • •

Física 1952

- for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith - Felix Bloch y Edward Mills Purcell

Química 1991

- for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst.

Química 2002

solution - for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three dimensional structure of biological macromolecules in Kurt Wüthrich

Fisiología o Medicina 2003

- for their discoveries concerning magnetic resonance imaging - Paul C. Lauterbur y Sir Peter Mansfield

Resonancia paramagnética electrónica (EPR)

• ¿Qué se detecta? Moléculas con uno o más electrones desapareados • ¿

En qué se basa?

- Los electrones desapareados tienen momento magnético de spin - El spin electrónico tiene dos números cuánticos que tienen la misma energía en ausencia de campo magnético - Cuando se exponen a un campo magnético se generan dos estados energéticos y por lo tanto una transición Meth. Enz. 246: 536

m s

= - ½

El experimento

h  Campo magnético (B) Primera derivada m s

= ½

B o

Campo magnético (B)

B o

Campo magnético (B)

El espectro de EPR



E = h



= g B

o

β

g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre) β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón; 9.2741 x 10 -24 JT -1 ) B o = Campo magnético aplicado  ~ 9.75 GHz para la banda X

Desdoblamiento hiperfino

• El campo magnético experimentado por el electrón

desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que tengan spin nuclear

Spin nuclear: Estados energéticos:

1 H  I = ½ I = ½: + ½, -½ 2 H  I = 1 I = 1: -1, 0, 1 12 C  I = 0 13 C  I = ½ 14 N  I = 1 15 N  I = ½ Núm. de líneas = 2n (I + ½) n = núcleos equivalentes

E

Desdoblamiento hiperfino

I = 1 : 14 N

m s ½ m I

1 0 -1

1 0 -1 -1 0 1

a N a N h 

- ½

-1 0 1 Desdoblamiento hiperfino Campo magnético

Desdoblamiento hiperfino Sin desdoblamiento 1 núcleo I=1/2 ( 1 H) 1 núcleo I=1 ( 14 N) 2 núcleos idénticos I=1/2 1 núcleo I=5/2 ( 17 O) 10 Gauss

El desdoblamiento hiperfino es aditivo H 3 C OH O N + N H O 4-POBN-CH(CH 3 )OH a N a N a H a H a H Campo magnético

Consideraciones acerca de líneas e intensidades

• (2 I + 1) líneas por cada núcleo • (2 I 1 + 1) (2 I 2 + 1) …. para más de un núcleo • (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes • El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no…

- Más de un radical con valores diferentes de g - Tiempo de correlación lento

• No hay una línea central intensa: número impar de núcleos

equivalentes con I = ½

Señales de EPR de iones metálicos de transición • Varían mucho según: i) el ion metálico ii) el estado de oxidación iii) el estado de spin iv) los ligandos v) el número de iones metálicos asociados • Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones spin spin cuando hay más de un electrón desapareado • A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N 2 o He líquidos) • Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico • Observables en iones metálicos con spines semienteros (S = ½, 3 ⁄ 2 , 5 ⁄ 2 ) pero no en iones con spines enteros (S =1, 2)

3d 5 3d 6 3d 9 3d 10 Configuración electrónica de algunos iones metálicos de transición Fe 3+ , Mn 2+ Fe Cu Cu 2+ 2+ + S = 5/2, (alto spin) S = 1/2, (bajo spin) S = 2, (alto spin) S = 0, (bajo spin) S = 1/2 S = 0

Galactosa oxidasa

JBC

(1988)

263:

6074

Biochemistry

(2009)

47:

6637

¿Quién está interesado en EPR para bioquímica?

1.

2.

3.

Áreas relacionadas con estrés oxidativo y antioxidantes Áreas relacionadas con catálisis enzimática que involucra radicales Áreas relacionadas con metaloproteínas no enzimáticas

Estrés oxidativo y antioxidantes

1969

Coenzima o cofactor Coenzima o cofactor Flavoproteínas Tetrahidropterinas Cu, Zn, Mn, Ni, Fe Quinoproteínas Enzima Enzima Flavoproteína oxidasas Óxido nítrico sintasa Hidroxilasas de aminoácidos aromáticos Óxido nítrico sintasa Superóxido dimutasas Metanol deshidrogenasa Hemo proteínas Metanol deshidrogenasa Amino oxidasas de cobre Citocromos P450 Peroxidases Complejos di-hierro Hierro mononuclear Catalasa Prostaglandina sintasa Metano monooxigenasa Ribonucleótido reductasa (clase I) Lipooxigenasa Catecol dioxigenasas Prolil-4-hidroxilasa

Chem. Rev.

(2006)

106:

3302

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática Ribonucleótido reductasa (RNR) clase I Fotosistema II Y D

·

Y Z

·

Prostaglandina H sintasa

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática RNR clase II RNR clase III piruvato formiato liasa citocromo peroxidasa

Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática Galactosa oxidasa Amina oxidasas de plasma Metilamina deshidrogenasa

Metaloproteínas no enzimáticas

Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS g ~ 2.07 Sangre venosa g ~ 2.08 Sangre arterial A x = 17 G g ~ 2.02

80 G A z = 17 G g ~ 2.00 g ~ 1.98 80 G g ~ 1.98

Kosaka et al., AJP 1994

Detección de radicales en biología por EPR Método Ventajas Desventajas 1. EPR directo (en solución) a. Estático b. Flujo rápido 2. EPR directo (muestras congeladas) 3. Spin-trapping Proporciona la estructura del radical Necesita muestras pequeñas Aplicable a radicales de vida larga (t ½ > min) Aplicable a radicales de vida corta Aplicable a radicales de vida corta ((t ½ < 10 -6 s) Necesita muestras pequeñas Proporciona información estructural en caso de complejos metálicos Necesita muestras grades, algunos radicales son indetectables Uso limitado en radicales orgánicos debido a la anisotropía Amplias aplicaciones Información estructural limitada

Espectros de EPR de plasma

Plasma Plasma + 0.5 mM ONOO Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996

EPR con flujo continuo

Detección de radical carbonato ONOO + CO 2 35%

CO 3 .-

+ .

NO 2 65% CO 2 + NO 3 HCO 3 /CO 2 ONOO Celda de mezcla Campo magnético 9 mm/ 5 ms

Detección de radical carbonato

ONOO + CO 2 65% CO 2 + NO 3 -

CO 3 .-

+ .

NO 2 ONOO HCO 3 /CO 2 ONOO H 13 CO 3 / 13 CO 2

Bonini et al. , JBC 1999

Detección de radical cromanilo

Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004

Detección de radical cromanilo

Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004

EPR directo con muestras congeladas • Aplicable a radicales de vida corta y metales de transición • 77 K (nitrógeno líquido) o 4 K (helio líquido) • Uso limitado debido a la

anisotropía

SPIN TRAPPING

ST + R

.

spin trap (diamagnético) radical transitorio SA

.

aducto de spin (paramagnético) • Gran aplicación pero brinda información estructural muy

limitada

• Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos

•

Spin traps de nitrona

DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido) Me Me + N O H • PBN (fenil-N-t-butilnitrona) C H + N O C ( C H 3 ) 3 R

.

R

.

Me Me N O .

R C H

R

H N O

.

C( C H 3 ) 3

+ Reaccionan con gran variedad de radicales (-RC

.

, RO

.

, RS

.

) + Los aductos son a menudo muy estables + No son demasiado tóxicos - La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares

Spin traps de compuestos nitroso

• MNP (2-metil-2-nitrosopropano) O N C (CH 3 ) 3 .

R .

O N R • DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato) C(CH 3 ) 3 O N Br Br SO 3 .

R Br .

O N R Br SO 3 -

+ Brindan una identificaciónmás fácil del radical Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz Forman dímeros inertes Poco confiables para radicales centrados en oxígeno

Spin trapping con proteínas

.

O Espectros de la reacción de HbO 2 con peroxinitrito en presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína N C(CH 3 ) 3 R MNP 1 mM HbO 2 1 mM ONOO 20 mM MNP 20 G + Pronasa 20 G 2 G acoplamiento superhiperfino

Romero et al., JBC 2003