Transcript Plx1

La replicación del DNA requiere a la
proteína Plx1 bajo condiciones de estrés.
Kristina Trenz, Alessia Errico y Vincenzo Costanzo
Leticia Rayas González
Plx1 y condiciones de estrés
Plx1
Inducción de
horquillas de
replicación
estancadas
es una cinasa
apagada
es el ortólogo de plk1
Afidicolina (APH) de la
(inhibe la replicación DNA
polimerasa II )
Etoposido (se une a la enzima
topoisomerasa II. Esto lleva a la
interrupción de la replicación y la
transcripción del ADN.
Reducción de complejos Mcm de
unión a ADN.
www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/picrender.fcgi...
Plk1
 Se expresa a través del ciclo celular pero su función durante la fase S es desconocida.
 Se une a la cromatina y suprime el puesto de control dependiente de ATM / ATR de
la interfase S que inhibe la activación del origen. Esto permite que Cdc45
desreprima el inicio de la replicación del ADN.
 La activación del punto de control aumenta la unión de Plx1 al complejo Mcm a
través de su dominio caja Polo. El reclutamiento de Plx1 a cromatina es
independiente de los mediadores del puesto de control Tipin y Claspina.
 El reclutamiento de Plx1 a cromatina y la recuperación de la replicación del ADN
bajo estrés requieren la fosforilación de la serina 92 de la proteína Mcm2
dependiente de ATR.
 La depleción de Plx1 conduce a la acumulación de roturas cromosómicas que se
previenen mediante la adición de Plx1 recombinante.
 Estos datos sugieren que Plx1 promueve la estabilidad del genoma mediante el
control de la replicación del ADN en condiciones de estrés.
Complejo
Mcm
Complejo Mcm
El
complejo
como helicasa
replicación.
Mcm
actúa
promoviendo la
En la fase G1, la Cdk (ciclina)
promueve la adición de Cdc6 para
reclutar a Mcm, formando un complejo
prerreplicativo.
Al inicio de la fase S, la Cdk-S
produce la disociación de Cdc6 y su
proteólisis,
exportando
a
Mcm
al citosol.
Punto de control del ciclo
celular en respuesta al daño
ATM y ATR fosforilan componentes de la red, directamente
(rojo 'P') o a través de cinasas CHK2 y CHK1 (negro 'P').
ATM / ATR y CHK2/CHK1 también afectan la reparación del
ADN, la transcripción, el ensamblaje de la cromatina y la
muerte celular.
www.nature.com/.../fig_tab/nature03097_F3.htm
Proteína Plx1 y la replicación del ADN
Western blot
¿Se requiere Plx1 para la
replicación del ADN ?
B: Replicación (120 Min.)
La depleción de Plx1 en interfase
no afecta la replicación del ADN.
¿Se requiere Plx1 en condiciones de estrés?
F: Plx1 activa no inhibe la replicación del ADN , en
cambio la depleción de Plx1 sí
Controles
A: Depletando Plx1 con anticuerpos.
Suplementando con Plx1 recombinante. (2000 núcleos/µl)
C: Limitando el número de orígenes de
replicación
D: Extractos suplementados con alto # de núcleos y dosis altas de geminina (GEM):No afectan la
replicación.
E: En la replicación con estrés inducido se fosforila Chk1, activando el punto de control dependiente de
ATM/ATR
¿La unión de Plx1 a cromatina mejora en presencia
de horquillas de replicación estancadas?
La unión Plx1/ Mcm7 cargado sobre
cromatina se incrementó arriba de 4 veces en
presencia de APH en comparación con el
control.
¿Cómo lo determinaron?
Comparando la unión de Plx1 y de Mcm7 a cromatina en presencia
de APH y GEM:
(A) En presencia de bajos niveles de DNA unido a complejos Mcm.
Con bajas cantidades de APH se observó un efecto similar al
control
(B) Cuantificaron la unión de Plx1 a cromatina y a Mcm7 en
presencia de APH (etapas tempranas de la replicación)
Puntos de control sensibles a cafeína
Western blot
A) Probar si los efectos
de Plx1 sobre el DNA
eran mediados por
puntos de control
sensibles a cafeína*
durante la interfase S
La cafeína podría restaurar la capacidad de la replicación del DNA en
ausencia de Plx1 y en presencia de APH o GEM
Lo que sugiere que Plx1 suprime el punto de control de la interfase S.
Regulación del disparo de origen
D) Se sugiere que Plx1
regula el disparo de
origen al disminuir los
niveles de fosforilación
de Plx1.
Controles
B) Midieron los efectos
de Plx1 sobre la
señalización de Chk1,
blanco del punto de
control de S sensible a
cafeína
C) Midieron el estado
de activación de Chk1
en condiciones de
estrés.
Arresto de la replicación, monitoreo de la unión de
Mcm y Cdc45 a cromatina
A) Para entender el mecanismo molecular
del arresto de la replicación se monitoreó
la unión a cromatina de los complejos Mcm
y Cdc45
Para verificar si el daño a Cdc45 reprime la
actividad Cdk2
B) Medición de la actividad nuclear por
monitoreo de la incorporación de 32P en la
histona H1 después de inmunoprecipitación
nuclear de Cdk2 con anticuerpos
Reclutamiento de Plx1 a la cromatina por Claspina al
inicio de la replicación (estrés).
Plx1 fosforila a Claspina, un mediador de la activación de Chk1 induciendo su liberación de la
cromatina y promoviendo la adaptación al punto de control que retrasa el comienzo de la mitosis.
Probar si la Claspina interviene en el reclutamiento de Plx1 a cromatina.
(B) La acumulación de Plx1 en la cromatina inducida por horquillas de replicación estancadas no se
afecta por la ausencia de Claspina
Controles:
(A) Depleción de Tipin
Interacción de Plx1 con Mcm durante la fase S
(C) Interacción de Plx1 con Mcm para identificar
el mecanismo de reclutamiento de Plx1 a
cromatina
F) Plx1 es incapaz de unirse a cromatina en
extractos depletados del complejo Mcm lo que
sugiere que Mcm es el mayor sitio de unión de
Plx1 a cromatina durante la fase S.
Importancia de Mcm para la función de Plx1
D) Identificación de la región
de Plx1 que se une a Mcm
Mcm2, Mcm4, Mcm6 y Mcm7
E)¿La unión de la caja Polo a
proteínas Mcm se incrementa
con la activación del punto de
control? Sí y se inhibe con
cafeína.
Requerimiento de fosforilación serina 92 de
Mcm2 para la función de Plx1
Mcm2 es fosforilada sobre la serina 92 por ATM/ATR y su
fosforilación puede estar inducida por APH o
etoposido
Sustitución de serina
por alanina
A)
Para Probar si la fosforilación de esta serina tiene que
ver en el papel del reclutamiento de Plx1 a Cromatina
y en la supresión del punto de control mediado por
Plx1, se produjo un Mcm2 recombinante
B)
¿Plx1 recombinante restaura la replicación de DNA
bajo condiciones de estrés con Mcm2-WT o con
Mcm2 recombinante?
Plx1 previene el rompimiento cromosomal
durante la replicación del DNA
¿La ausencia de Plx1
conduce a la pérdida
de la integridad del
genoma?
Se midió el incremento de
rompimientos cromosomales
en ausencia de Plx1
reduciendo los niveles de
unión de Mcm a DNA
Activación del origen de replicación durante la
fase S
Gracias