Transcript prezentare diagnostic genetic MPN 31 ianuarie 2015

Mutații etiopatogenetice în neoplasmele
mieloproliferative – posibilități și
probleme de diagnostic
Adrian Trifa, Andrei Cucuianu, Ioan V. Pop, Radu Popp
UMF “Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca
HEMATOPOIEZA
MĂDUVA
SÂNGE
CELULE STEM
PROGENITORI
PRECURSORI
DIFERENTIERE
AUTOREÎNNOIRE
PLURIPOTENTE MULTIPOTENTE
AUTOREÎNNOIRE
LIMITATĂ
UNI SAU BI
POTENŢIAL
FĂRĂ AUTOREÎNNOIRE
MATURATIE
CELULE MATURE
LIMFOCITE T
CFU
Ly
LIMFOCITE B
BFU-E
CFU-E
ERITROCITE
TROMBOCITE
CFU
GEMM
CFU-MEG
CFU
GM
NEUTROFILE
MONOCITE
EOZINOFILE
CEU-EO
BAZOFILE
Neoplasmele mieloproliferative (NMP)
- Grup heterogen de afectiuni hematologice MALIGNE, provenind din
transformarea unei celule stem multipotente
hematopoieza clonala
hiperplazie medulara a unei (unor)
linii mieloide
Trasaturi comune
cresterea valorilor elementelor figurate
care deriva din linia (liniile) mieloide
transformate
modificari medulare mai mult sau mai
putin specifice
(Vainchenker et al, 2005; Kralovics et al, 2005)
NMP – clasificarea OMS din 2008
- NMP pozitive pentru fuziunea BCR-ABL
leucemia mieloida cronica (LMC)
- NMP non BCR-ABL
policitemia vera (PV)
trombocitemia esentiala (TE)
mielofibroza primara (MP)
leucemia cronica cu eosinofile/sindromul hipereosinofilic
leucemia cronica cu neutrofile (LCN)
mastocitoza sistemica (MS)
NMP
Cancere rare
Incidenta: spre 1/100,000/an pentru PV, TE si
LMC
- <<1/100,000/an pentru MFP
- <<<<<<< 1/100,000/an pentru celelalte
Prevalenta mult mai mare insa (evolutie cronica,
indelungata, mai ales in cazul TE)
Leucemia mieloida cronica
Primul NMP caracterizat din punct de
vedere genetic
46,XX,t(9;22)(q34;q11) => fuziunea BCR-ABL
Nested RT-PCR pentru BCR-ABL
Monitorizarea tratamentului cu TKI – Realtime RT-PCR o data la 6 luni, sau, dupa
caz, si mai frecvent.
Policitemia vera, trombocitemia esentiala si mielofibroza primara
(c-MPL)
(c-MPL)
(Tefferi et Vardiman, 2008)
JAK (Just Another Kinase, Janus
kinase)
JAK2 V617F
Efectul mutatiei JAK2 V617F
Bennett and Stroncek Journal of Translational Medicine 2006 4:41
Detection of JAK2 p.V617F mutation by tetra-primer
PCR technique- schematic representation
External Fw
V617F
X
Fw Normal
External Rev
Rev Mutant
Control fragment
Normal allele specific fragment
279pb
Mutant allele specific fragment
463pb
229pb
JAK2 p.V617F tetra-primer PCR 3% agarose gel electrophoresis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
463bp
279bp
229bp
500bp
1, 2, 4, 7 – normal allele homozygotes
3, 11, 12 – mutant allele predominance, minimal normal allele
5, 6, 8, 9, 10 – heterozygotes with variable mutant/normal allele proportion
13 – 100bp DNA molecular weight marker
JAK2 V617F = >90% PV
- aprox. 50% TE si PMF
Effect of the c-MPL mutations
Detection of c-MPL mutations by AS-PCR technique –
schematic representation
External Fw
W515K/L
X
Fw Mutant
External Rev
Control fragment
Mutant allele specific fragment
MPL = 5% TE si PMF
CALR (Calreticulin) mutations
Type 1 mutation
Type 2 mutation
Nangalia et al, 2013; Klampfl et al, 2013
Detection of CALR mutations by AS-PCR technique –
schematic representation
Fw
Type 2
X
mutation
Type 1
X
mutation
Rev
Unmutated CALR fragment
Type 1 mutation fragment
Type 2 mutation fragment
Trifa et al, 2014
CALR = 30% TE si PMF
Somatic mutations in MPNs - chronology
Kralovics
et al,
2005
Pikman
et al,
2006
JAK2 V617F
(2005)
Nangalia
et al,
2013
Klampfl
et al,
2013
MPL
CALR
(2006)
(2013)
ALGORITM DE DIAGNOSTIC AL NEOPLASMELOR MIELOPROLIFERATIVE
NON-BCR-ABL
PV? (CRITERIILE
OMS 2008)
JAK2 V617F
NEGATIV
JAK2 EXONUL 12
NEGATIV
JAK2 V617F
POZITIV
JAK2 EXONUL 12
POZITIV
PROBABIL NU PV
POLIGLOBULIE
SECUNDARA
PV
PV
ALGORITM DE DIAGNOSTIC AL NEOPLASMELOR MIELOPROLIFERATIVE NON-BCR-ABL
TE/PMF? (CRITERIILE OMS
2008)
JAK2 V617F NEGATIV
CALR NEGATIV
MPL NEGATIV
CALR POZITIV
MPL POZITIV
TE/PMF TRIPLU-NEGATIVA
SAU ALTA ENTITATE
TROMBOCITOZA
REACTIVA?
JAK2 V617F POZITIV
TE/PMF
TE/PMF
TE/PMF
Mastocitoza sistemica
Detection of c-KIT p.D816V mutation by AS-PCR
technique – schematic representation
External Fw
D816V
X
Fw Mutant
External Rev
Control fragment
184pb
Mutant allele specific fragment
90pb
c-KIT p.D816V mutation 2% agarose gel electrophoresis
1
2
3
4
5
184bp control
fragment
90bp mutant allele
specific fragment
1, 2, 3 – healthy individuals, negative controls for c-KIT
p.D816V mutation
4 – mast cell disease patient; D816V positive
5 – 100bp DNA molecular weight marker
Hipereosinofilia clonala
Tefferi and Vardiman, 2008
Fuziunea FIP1L1-PDGFRA =
15% din pacientii cu
hipereosinofilie clonala
=> raspuns excelent la TKI
LEUECMIA CRONICA CU
NEUTROFILE
Pardanani et al, 2013
DISPONIBILITATEA
TESTARII ?
ACCESUL PACIENTILOR LA
TESTARE ?
VA MULTUMESC!!!