Transcript pobierz

Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Katedra i Klinika Okulistyki
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski
Monika Jasielska
Rola receptora czynnika martwicy guza α Rp75 (TNFRp75)
w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej
Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz
Lublin 2010
Neowaskularyzacja naczyniówkowa
(choroidal neovascularization – CNV)
• rozrost małych naczyń pochodzących z naczyń włosowatych
naczyniówki, które poprzez błonę Brucha przedostają się
do przestrzeni pod nabłonkiem barwnikowym siatkówki, jak i w obręb
komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i fotoreceptorów;
• patologiczne naczynia są niepełnowartościowe, mniej wytrzymałe, bardziej
kruche i mają kręty przebieg;
• nieszczelność nowo powstałych naczyń skutkuje przeciekiem płynu lub krwi,
które, kumulując się w przestrzeni podsiatkówkowej, powodują surowicze
lub krwotoczne odwarstwienie nabłonka barwnikowego siatkówki;
• prowadzi do powstania tarczowatej, włóknistonaczyniowej blizny
Neowaskularyzacja naczyniówkowa
Schorzenia w ystępujące z neow askularyzacją naczyniów kow ą
Zw yrodnieniow e
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem
Zwyrodnienie krótkowzroczne
Pasma naczyniaste
Genetycznie uw arunkow ane
Dystrof ia żółtkowata plamki
Dno żółtoplamiste
Druzy tarczy nerwu wzrokowego
Zapalne
Zespół histoplazmozy ocznej
W ieloogniskowe zapalenie naczyniówki
Pełzające choroiditis
Toksoplazmoza
Toksokaroza
Różyczka
Zespół Vogta-Kayanagi-Harady
Zespół Behçeta
Zapalenie współczulne
Guzy
Znamię naczyniówki
Naczyniak naczyniówk i
Guzy przerzutowe naczyniówk i
Hamartoma nabłonka barwnikowego siatkówki
Urazow e
Pęknięcie naczyniówk i
Intensywna f otokoagulacja
Idiopatyczne
Neowaskularyzacja naczyniówkowa
• Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (age-related macular
degeneration – AMD) to degeneracyjna choroba oczu, która jest
najczęstszą przyczyną poważnego upośledzenia widzenia u osób po 50.
roku życia w krajach rozwiniętych.
• Istotą tego schorzenia jest pojawienie się zmian w centralnej części
siatkówki, w plamce żółtej, która odpowiada za widzenie centralne.
• Choroba ta prowadzi do ograniczenia w znacznym stopniu zdolności
wykonywania codziennych podstawowych czynności (np. czytania,
prowadzenia samochodu). AMD w znacznym stopniu obniża jakość
życia, skazuje osoby dotychczas samodzielne na opiekę osób trzecich
oraz często w znacznym stopniu obciąża ekonomicznie pacjenta i jego
rodzinę.
• W ostatnich latach obserwujemy stale rosnącą, liczbę chorych na AMD,
co jest związane z procesem starzenia się społeczeństw i powoduje
występowanie chorób typowych dla wieku podeszłego (w tym AMD) na
skalę epidemiczną.
• Przypadki zachorowań na AMD szacuje się na 2-10% u osób powyżej
50. roku życia i ponad 13% – po 85. roku życia. Szacuje się, że liczba
chorych w ciągu najbliższych 25 lat wzrośnie trzykrotnie. Można zatem
uznać, że w przypadku AMD mamy do czynienia z chorobą społeczną.
Koncepcje powstawania CNV
• zaburzenie równowagi pomiędzy czynnikami proangiogennymi
(czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor;
VEGF), czynnik wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor; FGF),
płytkopochodny czynnik wzrostu (plateled-derived growth factor; PDGF),
czynnik martwicy guza α (tumor necrosis factor α; TNFα)
i antyangiogennymi (czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego
siatkówki (pigment epithelium derived factor – PEDF), angiostatyna,
endostatyna)
– rola hipoksji, niedokrwienia, procesu zapalnego;
• zaburzenie funkcji nabłonka
barwnikowego siatkówki;
• dysfunkcja naczyń włosowatych
naczyniówki
Miller D.W.et al. 2003
Laserowy model CNV
• Indukowanie energią lasera pęknięć w błonie Brucha w celu
inicjacji neowaskularyzacji naczyniówkowej, której towarzyszy
niespecyficzna, lokalna reakcja zapalna.
Nabłonek barwnikowy
siatkówki
Błona Brucha
CNV
Naczynie włosowate
naczyniówki
Czynnik martwicy guza α (TNFα)
czynnik martwicy nowotworów, kachektyna,
inicjujący czynnik różnicujący (differention-inducing factor - DIF)
• plejotropowa cytokina prozapalna, regulująca różnicowanie i wzrost
komórek;
• wyizolowany po raz pierwszy w 1975 roku jako czynnik
odpowiedzialny za martwicę mięsaka myszy;
• trimeryczne białko kodowane przez gen X02910/X02159
w segmencie 6p23-6q12 na chromosomie 6;
• u osób dorosłych ekspresja tego genu, charakterystyczna przede
wszystkim dla makrofagów i monocytów, a w mniejszym stopniu dla
komórek NK, limfocytów, neutrofilii, komórek tucznych, fibroblastów,
keratynocytów, adipocytów;
• występuje w formie rozpuszczalnej (17 kD) i transbłonowej (27 kD)
Czynnik martwicy guza α (TNFα)
wpływ na komórki układu
odpornościowego oraz
uczestniczące w regulacji
reakcji immunologicznej
białko ostrej fazy, które inicjuje
aktywację kaskady cytokin i
zwiększa przepuszczalność
naczyń, rekrutuje makrofagi i
neutrofile do miejsca zapalenia
odpowiedzialny za powstawanie
zmian miażdżycowych i
niewydolności krążenia,
zapalenie trzustki oraz
alkoholowe uszkodzenie wątroby
długotrwałe wydzielanie TNFα, indukującego lipolizę
oraz pobudzającego wydzielanie hormonów
katabolicznych, prowadzi do kacheksji
powoduje martwicę pewnych typów
nowotworów, ale również promuje wzrost
innych typów komórek nowotworowych
TNFα
częściowo odpowiedzialny
za insulinooporność
niskie stężenie TNFα pomocne
w utrzymaniu zrównoważonego
dobowego rytmu ciała
udział w schorzeniach autoimmunizacyjnych,
w odrzucaniu przeszczepów, w reakcji
przeszczep przeciw gospodarzowi oraz w
przebiegu AIDS
TNFα w powstawaniu CNV
TNFα
Ekspresja VEGF
przez komórki nabłonka
barwnikowego siatkówki
Aktywacja białek jądrowego
czynnika kappa B (NFκB)
Ekspresja białek adhezyjnych
(tj.: ICAM-1, VCAM, CD18)
przez komórki śródbłonka i
leukocyty
Receptory czynnika martwicy guza α
Receptor TNFRp55
(TNFRβ, p55, CD120α)
Receptor TNFRp75
(NFR2, TNFRα bądź CD120β)
masa cząsteczki 55 kDa
masa cząsteczki 75 kDa
występuje na większości komórek jądrzastych
występuje przede wszystkim na leukocytach oraz
komórkach śródbłonka
wiąże formę błonową i rozpuszczalną TNFα
wiąże głównie formę transbłonową TNFα
wewnątrzkomórkowy fragment - domena śmierci
(death domain – DD) odpowiedzialny za mechanizmy
komórkowe prowadzące do aktywacji kaspaz i
apoptozy
część cytoplazmatyczna wiąże się bezpośrednio
z białkami adaptorowymi - TRAF1 i TRAF2 - które
łączą się z różnymi białkami uczestniczącymi w
przekazywaniu sygnałów
zaangażowany w apoptozę i aktywację jądrowego
czynnika kappa B (NFκB)
aktywacja (przez receptor TNFRp75) jądrowego
czynnika kappa B (NFκB) w komórkach śródbłonka
stymuluje ekspresję genów antyapoptozy i wzrost
przeżywalności komórek śródbłonka;
niezbędny dla ekspresji genów VEGF związanych z
NFκB
aktywacja TNFRp55:
- powstanie procesu zapalnego,
- zahamowanie migracji komórek śródbłonka,
- apoptoza komórek śródbłonka
wpływa na proliferację limfocytów, promuje aktywację
komórek śródbłonka, ich migrację i przeżycie poprzez
aktywację specyficznej mu kinazy Etk/Bmx, która
bierze udział w migracji komórek śródbłonka i
tworzeniu naczyń in vitro
Cel pracy
• ocena angiogennej aktywności czynnika
martwicy guza α (TNFα)
• określenie roli receptorów TNFα: TNFRp55
i TNFRp75 w powstawaniu neowaskularyzacji
naczyniówkowej
Materiał i metody
• myszy linii C57/BL6 (szczep dziki; ang. wild type, WT) - grupa
referencyjna (n=10, 20 oczu)
• myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp55
(TNFRp55-/-) (n=10, 20 oczu)
• myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp75
(TNFRp75-/-) (n=10, 20 oczu)
Materiał i metody
• Fotokoagulacja laserowa:
aplikacja wokół tarczy nerwu
wzrokowego każdego oka
pięciu ognisk laserowych
o mocy 120 mW, średnicy
50 µm, czasie 100 ms
Materiał i metody
• Angiografia fluoresceinowa
14 dni po fotokoagulacji laserowej
Klasyfikacja przecieku fluoresceiny w angiografii fluoresceinowej myszy (wg Semkova)
Brak przecieku: +
Nieznaczna hiperfluorescencja, bez przecieku czy wzrostu wielkości
i intensywności.
Nieznaczne uszkodzenie tkanek.
Przeciek: ++
Hiperfluorescencja o wzrastającej intensywności, ale bez wzrostu
wielkości.
Umiarkowane uszkodzenie tkanek.
Przeciek: +++
Hiperfluorescencja,
wykazująca
wzrost
wielkości
i
intensywności
w trakcie badania.
Poważne uszkodzenie tkanek.
Przeciek: ++++
Zlewające
się
i
powiększające
się
obszary
hyperfluorescencji.
Siatkówka prawie całkowicie objęta przeciekiem. Często występująca
trudność odróżnienia pojedynczego ogniska.
Bardzo poważne uszkodzenie tkanek.
Materiał i metody
• Ocena histologiczna:
– Preparaty płaskie
• Barwienie histochemiczne z izolektyną – ocena unaczynienia
• Barwienie immunohistochemiczne z izolektyną i markerem
makrofagów F4/80 – wizualizacja naczyń i komórek zapalnych
– Preparaty parafinowe
• Barwienie hematoksyliną i eozyną – ocena struktury siatkówki
i naczyniówki
• Barwienie immunohistochemiczne z czynnikiem
von Willebrandta i z przeciwciałami anty-F4/80 - wizualizacja
naczyń i komórek zapalnych
• Barwienie immunohistochemiczne przeciwciałem anty-Bmx –
ocena proliferacji komórek
• Barwienie TUNEL – detekcja apoptozy komórek
Materiał i metody
• Analiza Western blot
– Ocena ekspresji białek czynnika martwicy
guza α
– Ocena ekspresji białek kaspazy 3 i kaspazy 8
Wyniki
• Ekspresja TNFα w nabłonku barwnikowym siatkówki i w naczyniówce myszy
linii C57/BL6, TNFRp55-/- i TNFRp75-/-, poddanych dzień wcześniej i dwa
tygodnie wcześniej fotokoagulacji laserowej (+) i myszy nielaserowanych (-).
1 dzień po fotokoagulacji
2 tygodnie po fotokoagulacji
Wyniki
• Angiografia fluoresceinowa
Wyniki
• A.Ogniska neowaskularyzacji
naczyniówkowej
obserwowane 14 dni
po fotokoagulacji laserowej
myszy TNFRp55-/- ,
TNFRp75-/- i myszy C57/BL6
w preparatach płaskich
barwionych izolektyną IB4.
Powiększenie 20x.
• B. Kwantyfikacja wielkości
ognisk neowaskularyzacji
naczyniówkowej (Qm2)
w preparatach płaskich
barwionych izolektyną.
Wyniki
• A. Ogniska neowaskularyzacji
naczyniówkowej
w preparatach płaskich myszy
TNFRp55-/-, TNFRp75-/i C57/BL6 – nałożone obrazy
podwójnego barwienia
izolektyną IB4 oraz
przeciwciałami anty-F4/80.
Powiększenie 20x.
• B. Powierzchnia ogniska
neowaskularyzacji
naczyniówkowej zajmowana
przez F4/80-dodatnie komórki
(wyrażona w % powierzchni
ogniska).
• C. Powierzchnia zajmowana
przez makrofagi poza
granicami ognisk lasera.
Wyniki
• Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej w preparatach myszy
TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 14 dni po zastosowaniu energii
lasera argonowego. Powiększenie 20x. Barwienia H+E, czynnikiem
von Willebrandta, przeciwciałem anty-F4/80.
Wyniki
• Ekspresja białek kaspazy 3 i kaspazy 8 w nabłonku barwnikowym
siatkówki i naczyniówce myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6
tydzień po fotokoagulacji laserowej w analizie Western blot.
• Wyniki analizy densytometrycznej ekspresji kaspazy 3 i kaspazy 8
trzech prążków trzech różnych badań (±SEM).
Wyniki
• Wyniki barwienia TUNEL oraz DAPI preparatów parafinowych
siatkówki i naczyniówki myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6
dwa tygodnie po fotokoagulacji laserowej. Powiększenie 20x.
Wnioski
• Receptory czynnika martwicy guza α: TNFRp55 i TNFRp75 biorą
udział w patomechanizmie powstawania neowaskularyzacji
naczyniówkowej po laserowej fotokoagulacji u myszy.
• W przebiegu neowaskularyzacji naczyniówkowej interakcje czynnika
martwicy guza α z receptorami TNFRp55 i TNFRp75 aktywują dwie
odmienne drogi, z których pierwsza prowadzi do apoptozy, a druga
do proliferacji i migracji komórek śródbłonka naczyń.
• Wyłączenie funkcji receptora TNFRp75 może skutkować
zmniejszeniem procesu zapalnego oraz ograniczeniem powierzchni
neowaskularyzacji naczyniówkowej, a tym samym mniejszym
uszkodzeniem tkanek u chorych z objawową neowaskularyzacją
naczyniówkową.
• Przedstawione dowody wskazują na potencjalne możliwości leczenia
neowaskularyzacji naczyniówkowej, wykorzystujące wiedzę na temat
roli receptorów TNFRp55 i TNFRp75 w powstawaniu
neowaskularyzacji naczyniówkowej.
Ze względu na wzrastającą liczbę osób w wieku podeszłym
i rozpoznawanie u nich nowych, dotychczas nieznanych
chorób narządu wzroku, konieczne jest nasilenie opieki
okulistycznej w środowisku życia tych osób.
Należy dołożyć wszelkich starań, aby poprawić jakość życia
pacjentów dotkniętych AMD oraz zmniejszyć ekonomiczne
i społeczne koszty inwalidztwa wzrokowego znacznego
odsetka społeczeństwa.
Dziękuję
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Katedra i Klinika Okulistyki
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski
Monika Jasielska
Rola receptora czynnika martwicy guza α Rp75 (TNFRp75)
w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej
Promotor: Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz
Lublin 2010