Transcript здесь
Инициация и усиление регенерации печени при ее тяжелом поражении или массивной резекции на основе моделирования естественного набора индукторов регенерации Э.И. Гальперин Отдел гепатопанкреатобилиарной и регенеративной хирургии НИИ Молекулярной медицины Особенности восстановления печени Печень – орган, выполняющий многочисленные функции. Ключевая роль печени в поддержании гомеостаза обуславливает особое место регенерации в её восстановлении. Повреждение органов сопровождается развитием соединительной ткани и образованием рубца. В печени происходит истинная регенерация с восстановлением объёма паренхимы органа. (резекция печени – резекция поджелудочной железы – резекция почки). Быстрое восполнение объема обеспечивает стабильную функцию организма в разных условиях. При тяжелых заболеваниях печени, когда остается 20-25% функционирующей паренхимы, регенерация не возникает, наступает смерть, несмотря на современное традиционное лечение Почему в оставшейся 20-25 % паренхиме печени нет регенерации? Cодержание АТФ в ткани печени крыс при ее 60 % и 80 % резекции 60 % рез. 80 % рез. 12 24 36 48 60 При 60% резекции При 80% резекции HGF – через 24-36 ч HGF – не выявлен TNF-α – не выявлен TNF-α через 6-12 ч. 72ч В оставшихся после резекции 20% функционирующей паренхимы печени снижается энергетический потенциал ткани, секретируется TNF-α, развивается апоптоз, регенерация не наступает. 3 Задачи Инициация регенерации при массивных поражениях печени, когда обычно она не возникает Усиление регенерации, когда она самостоятельно возникает, но темп ее должен быть усилен для скорейшего восстановления функции С чего начались исследования? В 1975 г. La Breque показал, что экстракт печени взрослых крыс, полученный из оставшихся 30% ткани печени после 70 % ее резекции, обладает действием, стимулирующим регенерацию печени – HSS (hepatic stimulator substance) Подсадка печени щенков собакам со смертельно поврежденной печенью приводит к восстановлению своей печени. Печень щенков удаляли на 3-й день (докторант Дугладзе Д.). Все собаки выжили. Мы на такой же модели смертельно поврежденной печени вводили экстракт печени щенков. Все собаки выжили. Дизайн исследований Схема получения HSS Эксперим. исследования (n = 700) Источник HSS – печень новорожденного поросенка, мышей и крыс, печень после 70% резекции гомогенизация, центрифугирование, прогревание, осаждение спиртом и т.д. Модели : сосудистая модель Мисра, 80 % резекция печени, введение тиоацетамида (ТАА) Функция печени: активность АСТ, АЛТ сыворотки крови, уровень холестерина и желчных кислот в желчи Подана заявка на патент «Способ получения вещества, стимулирующего регенерацию поврежденной печени» Пролиферация: стимуляции синтеза ДНК, РНК (Блобер и Потер), белка (Лоури), увеличение числа митозов (%). Действие HSS на летальных моделях повреждения печени Модель Mисра Выживаемость крыс при 80% резекции печени Схема операции б Холестерин Желчные кислоты Раннее (через 12-18 часов) восстановление функции печени и сохранение жизни животных Регенерация через 24 ч. после введения HSS: Увеличение синтеза ДНК на 229% p<0,001 Митозы – 3,4 % против 0 %. В контроле все погибли в сроки 16-23 час. HSS вызывает улучшение функции, инициацию регенерации печени и сохраняет жизнь животных при летальных моделях повреждения печени. Токсическое повреждение печенивведение тиоацетамида (ТАА) Активность (е/л) АСТ и АЛТ в сыворотке крови мышей ТАА (48 час) 2648 1804 ТАА + HSS (48 час) 2100 4300 920 940 1580 1620 215 153 АСТ , р<0,001 исходный уровень АЛТ, р<0,001 введение ТАА АСТ, р<0,001 HSS крысы после 70 % резекции АЛТ, р <0,001 HSS неонатальн. поросёнка Регенерация к 24 ч. после введения HSS (опыт vs. контроль) ДНК в гомогенате – 240 % , p < 0,001. ДНК в ядрах – 330 % , p< 0,001. Белок – 275% Митозы – 2,2-9,4 % vs 0,4-1,6 % HSS способствует достоверному снижению цитолиза и усилению регенерации при токсическом повреждении печени 8 Предварительное заключение На 3 моделях тяжелого повреждения печени показано, что экстракты, полученные из печени различных животных (после 70% резекции печени половозрелых крыс, печени щенков, неонатального поросенка) вызывают: улучшение функции поврежденной печени инициацию и усиление регенерации полученный экстракт обладает видовой неспецифичностью Введение экстракта приводит к выживанию большинства экспериментальных животных Современные представления о регенерации. Механизм действия HSS. Регенерацию рассматривают не столько как пролиферацию зрелых клеток, а как дифференцировку стволовых клеток, то есть их способность под действием определенных сигналов, исходящих из специфического окружения, приобретать свойства клеток поврежденного органа Предположение: Экстракт из резецированной печени или печени неонатального поросенка, создавая такое «специфическое» окружение стволовых клеток, вызывает их направленную дифференцировку в клетки гепатоцитарного ряда HSS - экстракт резецирова нной печени или печени неонатального Так ли вэто? животного может создать окружение поврежденном очаге печени, благоприятствующее репаративн регенерации и оказать влияние на Исследование HSS на пролиферацию гепатоцитов in vivo и in vitro In vivo : модель повреждения печени – введение ТАА (мыши) HSS вводили в/брюшинно исследовали морфологическое состояние печени, сигнальный путь Ras/MARK (активность танкиразы) In vitro: изучали рост различных клеток в культурах при введении различных доз HSS, гепатопротекторов, активность танкиразы Влияние HSS на пролиферацию гепатоцитов после повреждения печени ТАА и активность фермента танкиразы (сигнальный путь Ras/МАРК) а Реактивные гепатоциты 48 час после введения HSS б в Повреждение центролобулярных областей (а,б) после введения ТАА. Апоптоз, разрывы ДНК (в) Фагоцитоз апоптозного тельца Повышение активности танкиразы предшествует появлению реактивных гепатоцитов Активность танкиразы через 24 ч. после введения ТАА Влияние HSS на изолированные клетки в культуре Культуры клеток: 1. гепатоциты человека Huh7 2. первичные культуры клеток печени 3. фибробласты линии L 4. МСК из костного мозга и жировой ткани Влияние HSS на культуру гепатоцитов Huh7 Сравнение влияния HSS и FBS на пролиферацию гепатоцитов Huh7 Зависимость пролиферации от дозы HSS Влияние HSS и эссенциале на пролиферацию гепатоцитов В отсутствие FBS HSS способствует росту клеточных культур гепатоцитарного ряда, эффект дозозависимый. Избирательность влияния HSS на гепатоциты (Huh7) в сравнении с фибробластами (линия L) Huh7 L инкубация с FBS инкубация с HSS инкубация в среде без гуморальных факторов HSS поддерживает пролиферацию клеток гепатоцитарного ряда, но не фибробластов Влияние HSS на мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из костного мозга мыши инкубация с FBS инкубация с HSS Инкубация МСК с HSS в течение 2-4 недель приводит к гибели части клеток и к селекции оставшихся Селекция МСК из костного мозга крысы RS 12 (исходная линия МСК) RSH (после селекции в присутствии HSS) Путем селекции в присутствии HSS могут быть получены длительно (до 2 лет) живущие клеточные линии RSH Влияние HSS на МСК костного мозга МСК+HSS Гепатоцитоподобные клетки? HSS вызывает гепатоцитарную дифференцировку стволовых клеток ?! МСК из жировой ткани трансгенной мыши, экспрессирующей GFP План эксперимента по изучению трансплантации клеток линии RSHD1, экспрессирующих GFP фазовый контраст Инкубация с HSS получение RSHD1 флуоресценция Трансплантация гепатоцитоподобных клеток линии RSHD1 живым мышам с поврежденной печенью. На рисунке печени видны «зеленые» островки меченых трансформированных СК Результаты воздействия HSS Увеличение активности танкиразы – фермента сигнального пути RAS / Mark – через 24 часа после введения HSS на модели поврежденной печени В отсутствии бычьей сыворотки HSS поддерживает рост клеток гепатоцитарного ряда и вызывает гибель фибробластов Инкубация МСК с HSS в течение 2-4 недель приводит гибели части клеток и к селекции оставшихся в направлении клеток гепатоцитарного ряда. Для доказательства – необходимо фенотипирование. Действующее начало HSS Существует один ключевой агент регенерации. Основным действующим веществом в составе HSS считается открытый в 1980-1990х годах белок ALR (augmenter of liver regeneration), продукт гена Gfer (Growth factor erv1-like) Hagiya et al., 1994; Gatzidou et al., 2006 Необходима активация одного сигнального пути с участием нескольких компонентов Необходим комплекс сигнальных молекул (цитокины, ростовые факторы и др.) Nelson Fausto и соавт, 2006 Выделение отдельных факторов из экстракта регенерирующей печени ( ALR, HGF, TNF α, TGFß, цитокины и т.д) и попытка применения одного из них или комбинации нескольких, составленной по логическим соображениям, не приносят стабильных успешных результатов Наша концепция Для восстановления печени следует применять не отдельное биологическое вещество или их логическую комбинацию, а естественный набор биологически активных соединений, где отдельные субстанции находятся в закономерном соотношении друг с другом Очистка экстракта из ткани печени Фракционирование экстракта печени неонатального поросенка путем гель-фильтрации (на колонке Toyopearl-HW50S) . . HSS представляет собой сложную смесь веществ, множество пиков хроматограммы собраны в 4 фракции 22 Удельная активность фракций HSS ед ед / мг / мг ед / мг HSS 1 2a 4 HSS АСТ 1 2a 4 АЛТ 1 – фракция 1; 2а – фракция 2а; 4 - фракция 4. Фракция 1, 2а и 4 проявляют достоверно большую удельную активность по сравнению с HSS. Фракция 1 превосходит удельную активность HSS в 9,6 и 10,5 раз по снижению активности АСТ и АЛТ соответственно 23 Изучение состава фракций Полипептиды с молекулярной массой 3-35 кДа. Нуклеотиды – 1 фр.: не более 10 или отдельные нуклеотиды, 2а фр.: - 20-5000 нуклеотидов Липиды – фосфолипиды и нейтральные жиры (преобладают жирные кислоты и триглицериды) Активность белково-полипептидного *) компонента фракции 1 АСТ АСТ ед/л АЛТ АЛТ ед/л А 1 ППК А 1 ППК A – контроль (ТАА); 1 – фракция 1; ППК – полипептидный компонент фракции 1. *) Полипептиды из фракции 1 осаждали раствором сульфата аммония до 75 %, диализировали, центрифугировали, лиофилизировали, растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным. Т.о. в результате проведенного этапа очистки HSS получен белковополипептидный компонент с молекулярной массой 3-35 кДа, обладающий удельной активностью в 10 раз превосходящую активность HSS. Идентифицированные белки и пептиды (масс-спектрометрия фракций HSS) Идентифицированные белки и пептиды (масс-спектрометрия фракций HSS). Продолжение Сопоставление содержания белков в активных и неактивных фракциях Критерии исключения белков из последующего рассмотрения Доминирует по содержанию в неактивной фракции 2b. Не содержится в одной из активных фракций 1 или 2a. Содержатся в активных фракциях 1 и 2a, различия не более, чем в 5 раз Сопоставление содержания белков в активных и неактивных фракциях (продолжение) Вероятные кандидаты Маловероятные кандидаты Продолжение Вероятные кандидаты Маловероятные кандидаты Выбрано 12 кандидатных белков, с которыми может быть связана активность HSS Анализ биологических свойств Проведен анализ описанных в литературе биологических свойств выбранных 12 белков Выбраны 6 кандидатов, которые могут обладать биологической активностью 1. Alpha-2-HS-glycoprotein (фетуин А) − вырабатывается гепатоцитами, больше в эмбриональном периоде, может влиять на развитие, взаимодействует с различными лигандами 2. Cysteine and histidine-rich domain-containing protein 1 − может влиять на клеточные сигналы, взаимодействуя с NOD1 и heat-shock protein 90 3. Saposin-B − взаимодействет с гликосфинголипидами, активирует их модификацию 4. Protein S100-G − кальций-связывающий белок из семейства кальмодулина 5. Prophenin-2 − антибактериальный, антивирусный, иммуномодулирующий 6. Apolipoprotein C-III − входит в состав липопротеинов высокой и очень низкой плотности, ингибирует фермент липопротеинлипазу Другие вещества, ассоциированные с белками и пептидами, которые могут определять активность HSS Примером могут быть гликосфинголипиды, связанные с белком сапозином, идентифицированным при массспекрометрии белковой фракции HSS Схематическая модель сапозина и ассоциированных с ним гликосфинголипидов Внеклеточная сигнальная молекула Сапозин – небольшой (9 кДа) термостабильный белок, ассоциированный с липидными мембранами ГЛИКОСФИНГОЛИПИД сапозин Клеточная мембрана Alattia J et al. PNAS 2007;104:17394-17399 Связывает и экспонирует в водную среду гликосфинголипиды, входящие в состав клеточных мембран Гликосфинголипиды участвуют в передаче внеклеточного регуляторного сигнала Регулируют рост и дифференцировку клеток Дальнейшие исследования Испытание коммерчески доступных белков из 6 наиболее вероятных кандидатов (в отдельности и в комбинации, имитирующих их соотношение в HSS) на биологическую активность Испытание полученного набора, наряду с HSS, на направленную дифференцировку МСК в клетки гепатоцитарного ряда Заключение Разработана оригинальная технология получения HSS из регенерирующей и неонатальной печени. В результате настоящего этапа очистки HSS получен белково-пептидный комплекс с мол. массой 3-35 кДa, состоящий из 30 белков и пептидов и обладающий удельной активностью в 10 раз превосходящей активность исходного экстракта. Идентифицированы 6 белков, вероятно, обладающих биологической активностью Доказана эффективность использования HSS на летальных и токсических моделях печеночной недостаточности, выявлено избирательное действие HSS на стимуляцию пролиферации клеток гепатоцитарного ряда, отмечен дозозависимый эффект Заключение (продолжение) Доказано участие сигнального пути Ras/MARK (по усилению активности танкиразы) в пролиферации гепатоцитов под влиянием HSS Впервые получены данные о возможной индукции МСК in vitro при действии HSS , что требует дальнейшего фенотипического подтверждения Следует продолжить дальнейшие исследования, сосредоточив усилия на : 1 - уяснении роли HSS в направленной дифференцировке стволовых клеток в клетки гепацитарного ряда, 2 – определении конкретных белков и других соединений, обладающих биологической активностью для создания синтетического препарата по матрице естественных индукторов регенерации. Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН Институт органической химии РАН НИИ Митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова, Участники проекта ГНЦ «Институт иммунологии» МЗ РФ Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Участники проекта Э.И. Гальперин, Т.Г. Дюжева, Л.В. Платонова, А.В. Люндуп, М.В. Ковина, М.Е Крашенинников, Р.И. Атауллаханов, А.Н. Куимов, А.В Пичугин,. А. М. Дудченко, О.Ю. Абакумова, М.А. Батин, А.В. Алесенко,Т.М. Мельникова, В.Н. Манских, А.С. Жожикашвили, А.И. Никифорова, М. А. Монаков. Спасибо за внимание ! Работа была поддержана Грантами РФФИ, Президиума РАН «Фундаментальные науки медицине», ФЦП Министерства образования РФ В настоящее время поддерживается Внутриуниверситетским грантом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова