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花生AhNCED1基因启动 子的克隆及初步分析 梁建华 指导老师：李玲 教授 我国是世界重要的花生生产、消 费和出口国。广东是重要的花生产区， 种植面积的60%以上分布在干旱、半干 旱地区。干旱胁迫是提高花生产量和 品质的主要制约因素之一。研究花生 的抗旱机制具有实际应用价值和理论 指导意义。 • 脱落酸(ABA)参与了植物生长发育 过程, 作为胁迫激素调节植物对外 界胁迫条件的适应。 干旱 信号感受 ABA 蛋白质合成（MYB、MYC） MYCRS、MYBRS（rd22） bZIP ABRE（rd29B） 基因表达 胁迫应答、产生胁迫耐性 在生物胁迫和非生 物胁迫条件下, 植物体 内增加了ABA的含量, 这种效应主要是通过 激活ABA的合成及抑 制其降解途径实现的, ABA水平的升高是胁迫 反应的第一步。 高等植物ABA生物合成途径 关键基因 研究基础 • 从耐旱花生品种粤油７号的叶片中，克隆了 AhNCED1基因。 • 发现其表达受干旱胁迫诱导，而且干旱胁迫下，抗旱 性强的花生品种中AhNCED1基因表达水平要高于抗 旱性相对弱的品种，与ABA累积水平一致。 • 异位表达AhNCED1基因提高转基因拟南芥ABA含量， AhNCED1基因回复129B08/nced3突变体对水分胁迫 的超敏性，外源ABA也回复129B08/nced3突变体对水 分胁迫和山梨醇的敏感性。 花生耐旱品种在干旱 条件下NCED基因高表 达的原因和抗旱的分子 机理 ? 克隆启动子的方法 • 启动子探针质粒载体筛选启动子 利用载体的PCR 基因组 步行技术 • PCR 技术 利用接头的PCR (Genomic Walking) TAIL-PCR Inverse-PCR(I-PCR) 环状PCR Panhandle-PCR(P-PCR) 利用双链接头介导的基因组DNA步 行技术 • 基因组DNA用限制性内切酶彻底酶切,产生平末 端;连接特殊“接头”（adaptor），构建成不同 的“DNA片段库” ； • 利用接头引物（AP）和根据AhNCED1 基因 cDNA 5’-端序列设计基因特异性引物（GSP)， 以不同的“DNA片段库”为模板，进行巢式 PCR（Nested PCR）反应。 构建DNA片段库（DNA library) Unkown sequence 巢式PCR (nested PCR) 双链DNA接头： 5’GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCG GGCTGGT- 3’(+) 3’- NH2-CCCGACCA- 5’(-) 根据接头序列设计接头引物： AP1：5’GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ AP2：5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’ 基因特异性引物（GSP) Original cDNA Sequence: 基因组DNA完整性及纯度检测 １人类基因组DNA（0.1µ g/µ l) 2 花生基因组DNA ３Dra І 酶切花生基因组DNA Examination of nested PCR products on an agarose/EtBr gel Lane 1－4: nested PCR amplification with DNA Labrary templates resulting from DraI、AluI、 HaeⅢ and ScaI digestion, respectively. Lane 5: negative control for PCR 单引物检测 1.ScaІ Library;2.AP2单引物对照; 3.GSP2单引物对照; 4.negative control for PCR 启动子序列分析 • 与拟南芥AtNCED3启动子序列并没有相似性。 • 翻译起始密码子ATG上游启动子序列为2435bp。 • 上游-246~-240存在TATA box， -323~－319存在 CAAT box序列，－211处的A可能为转录起始位 点。 • 存在脱落酸信号转导下游响应元件、MYC蛋白识 别位点、水杨酸响应元件及植物伤害响应元件等 顺式作用元件。 脱落酸信号响应元件（ABRE ） • ABRE是依赖于ABA表达基因的一种主 要的顺式作用元件。 • 其核心序列是： PyACGTGGC ，这个序 列首先在小麦的Em基因和水稻的RAB16 基因中被发现的。 • Em基因主要在种子成熟过程中起作用。 • RAB16基因在种子成熟过程中和干旱胁迫条 件下表达。 • 单个ABRE序列对于基因的表达往往是 不够的 ，如拟南芥的抗逆基因RD29B 启动子中的复合体是由两个ABRE元件 共同组成的。 • 水分胁迫诱导的AhNCED1基因的表达 调控可能属于依赖ABA的信号转导途径 水分胁迫诱导基因的表达调控 工作展望 • 构建植物双元表达载体，转化拟南芥，分 析启动子的功能和时空表达模式。 • 鉴定干旱响应元件，为研究AhNCED1基因 表达调控机制及其响应水分胁迫的信号通 路奠定基础。 • 分析调节启动子活性的因素。 • 分离与ABRE结合的转录因子。 恳请各位领导和专家 批评指正 我们一直在努力......