Transcript 蛋白质组学质谱分析技术及应用进展

[现代生物产业前沿关键技术高级研修班 ]
蛋白质组学质谱分析技术及应用进展
俞梅兰
2013.10.20
现代生物产业前沿关键技术高级研修班
蛋白质组研究中的复杂性
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质谱定义：
将未知分子电离或解离成各种不同质核比m/z的
粒子，并在电场、磁场或电与磁混合场的作用下，
将它们逐一分离和检测。
根据质谱的断裂过程和机理，m/z值得相对丰度来
确定未知物的分子量，推断未知物的可能结构。
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质谱的分类
根据研究对象不同而划分
无机质谱
有机质谱
研究对象为有机小分子
MW:几百---几千
生物质谱
研究对象为生物大分子，如蛋白质、核酸等
MW:几千---几十万
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质谱仪组成
进样装置
离子源
数据系统
质量分析器
真空系统
离子检测器
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电喷雾（ESI)
基质辅助激光解吸（MALDI)
软电离技术
生物质谱
蛋
白
质
分
子
量
测
定
蛋
白
质
鉴
定
蛋
白
质
相
互
作
用
翻
译
后
修
饰
定
量
蛋
白
质
组
学
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质谱法实现蛋白质鉴定
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三个层次的蛋白质序列研究
将蛋白质用某种酶进行酶解后，产生的肽段质量的信息。（MS图谱）
1.肽质量指纹谱
（PMF,Peptide Mass Fingerprinter)
2.多肽碎片离子
数据库检索
（Peptide Fragment Ions)
将蛋白质酶解后产生的肽段进行碰撞诱导解离，产生的碎片质量制成的信息。（MS/MS图
3.多肽序列标签
（PST,Peptide Sequence Tag)
对于数据库中没有收录的蛋白质，可以通过
MS/MS图谱进行DE nove获得多肽序列，或查询基
因组翻译库实现蛋白鉴定。
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数据库检索
数据库检索主要参数设定：
数据库选择
蛋白质归属物种选择
酶解用酶的选择、可能漏切位点数
修饰类型的选择
数据库检索类型的选择
MS、MS/MS质量精度Tolerance的选择
使用质谱仪类型的选择
。。。。。
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2DLC或
LC-SDS-PAGE
蛋白质质谱鉴定流程
组织、细胞
或体液
超声、离心
处理
双向电泳
蛋白质提取液
不同馏峰或
蛋白质电泳带
酶
解
序列数据库
成功鉴定
PSMs及后筛选
PMF
肽指纹图谱
一级质谱
数据库检索
未知蛋白
酶解片段
（多肽混合物）
串联质谱
De-nove序列分析
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2DE-MALDI-TOF/TOF MS技术平台
考染成功率大于90%，银染也可达到85%。
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参考文献
1.Zhu X, Ding M, Yu ML, Feng MX, Tan LJ, Zhao FK.Identification of galectin-7 as a potential
biomarker for esophageal squamous cell carcinoma by proteomic analysis.BMC
Cancer,2010,10:290.
2.Xia Gao, Hong-Yu Tian ,Mei-Lan Yu, Nai-He Jing, Fu-Kun Zhao.Comparative Proteomic Analysis of
Proteins Involved in Cell Aggregation during Neural Differentiation of P19 Mouse Embryonic
Carcinoma Cell. Journal of proteome research. 2009, 8, 1765.
3.Hong-Yu Tian, Ke-Hua Zhang , Xia Gao, Wei-Wei Lei, Liang Zhang, Mei-Lan Yu,Jian-Guo Song ,
Fu-Kun Zhao.Comparative proteomic analysis of cell cycle-dependent apoptosis induced by
transforming growth factor-β. Biochimica et Biophysica Acta. 2009,(1794): 1387.
4.Zhou ZH, Yang HJ, Chen M, Lou CF, Zhang YZ, Chen KP, Wang Y, Yu ML, Yu F, Li JY, Zhong
BX.Comparative proteomic analysis between the domesticated silkworm (Bombyx mori) reared
on fresh mulberry leaves and on artificial diet.J Proteome Res. 2008 Dec;7(12):5103.
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蛋白质组学相对定量分析方法
定量方法
直接比较
法
SDS-PAGE、
2DE、
HPLC
直接同位
素标记法
标记法
ICAT
SILAC
iTRAQ
2DDYGE
酶促18O
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同位素化学标记法（ICAT)
同位素化学标记法是通过与氨基酸的功能团发生
特素的化学键合反应,将同位素标记物引入蛋白进
行定量分析的一种提外标记方法。
ICAT是目前应用较光法的化学衍生标记试剂.
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同位素代谢标记法（SILAC)
同位素代谢标记以同位素
元素或同位素标记氨基酸
形式加入到细胞培养基中，
在细胞生长代谢过程中完
成蛋白质同位素标记.
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SILAC实验技术流程图
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同重同位素标签标记定量法(iTRAQ)
iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，
用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链
基团。标记后的肽段经过LC分离，进行MS和MS/MS
分析。
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iTRAQ试验流程图
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蛋白质相对定量方法比较
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LC-MS技术平台
shotgun(鸟枪法）---鉴定和分析蛋白质
蛋白定量
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常用搜库软件和网址
SEQUEST:http://www.thermo.com
MASCOT:http://www.matrixscience.com
Pfind:http://www.pfind.com
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