Transcript GFP - IJPB

La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine
incontournable pour l’imagerie du vivant
Exemples d’applications à l’étude du développement végétal
François Roudier
Equipe Différenciation et Identité Cellulaire
Biologie Cellulaire
Aequorea victoria : ”l’inventeur” de la GFP
La GFP : une protéine fluorescente par transfert d’énergie
La GFP : une structure en lanterne et un
fluorophore protéique auto-catalytique
- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles
- Forte stabilité : résiste à 65C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)
De la GFP sauvage à la GFP “améliorée”
Plusieurs mutations ont été introduites pour :
- Optimiser l’expression de la protéine
Usage optimal des codons et élimination d’un intron cryptique (20X plus de protéine)
Maturation du fluorophore (4X plus vite)
- Modifier les propriétés spectrales de la protéine
Pic d’excitation unique à 490 nm
Brillance (X6)
Un outil versatile pour l’étude du vivant…
La GFP : une protéine non toxique pour des
méthodes de visualisation non invasives
Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes
CFP GFP
YFP
(DsRED) RFP
Discosoma striata
Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales
Une plante modèle: Arabidopsis thaliana
Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire
et résulte de l’activité constante des méristèmes
Animal
Plante
Zygote
Embryon
Adulte
Organogenèse et
Croissance indéterminée
Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont
organisés en domaines fonctionnels
Méristème apical
feuille
méris tè me
pr imordium
ZC
ZP
MM
ZP
L1
L3
L2
Arabidopsis
adulte
Méristème racinaire
Exemples d’application de la technologie GFP à l’étude
du développement des plantes
- Profil d’expression d’un gène
- Etude fonctionnelle d’une protéine
Localisation subcellulaire
pPromoteur:GFP
(fusion transcriptionnelle)
pPromoteur:CDS::GFP
(fusion traductionnelle)
Mouvement
Interaction protéine-protéine (FRET)
- Biosenseurs
Le méristème racinaire : une organisation dépendante de
divisions stéréotypées des cellules souches
stele
endodermis
epidermis
cortex
Division asymétrique
lateral
root cap
quiescent
center
(QC)
cortex/
endodermis
initial
columella
Cell types in the
Arabidopsis
root meristem
Deux mutants déficients dans la mise en place et la
différenciation de l’endoderme
cor
end
Wild type
cor+end
scarecrow
(scr )
short-root
(shr )
cor
Expression de SCR dans la racine
cortex
Promoteur SCR
GFP gene
endodermis
ARN GFP
c/e initiale
QC
Protéine GFP
pSCR
GFP
Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP
cortex
Promoteur SCR
SCR gene
GFP
endodermis
c/e initiale
ARN
QC
SCR::GFP
pSCR
SCR GFP
(Complémentation du mutant scr)
SCR est nécessaire pour la mise et place et la
différenciation de l’endoderme dans la racine
cortex
cortex
endodermis
endodermis
c/e initiale
c/e initiale
QC
QC
pSCR
GFP
pSCR
SCR GFP
SHR contrôle la mise et place et la différenciation de
l’endoderme dans la racine de façon non cellule-autonome …
ep
ep co
st
co
st
en
en
in
pSHR
qc
GFP
in
pSHR
qc
SHR GFP
… La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme !
Analyse du transcriptome de l’endoderme racinaire
Digestion
paroi
pSCR:GFP
Récolte pointe
racinaire (15000)
Plantules in vitro
Hybridation
Puce Affymetrix ATH1
25K gene arrays
Triage par fluorescence
des protoplastes GFP+
Extraction ARN
Amplification
Marquage des sondes
300 000 protoplastes
Endodermis
Epidermis
Lateral
rootcap
Pericycle
Collection de
marqueurs spécifique
d’un type cellulaire
Endo
+
Cortex
QC
Le méristème apical caulinaire
Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle
pour la croissance, l’organogenèse et auto-maintien
Auto maintien
Organes
latéraux
ZC
ZM
ZM
ZM
Feuille
Jeune feuille
Tige
P
Primordium
Le méristème apical caulinaire
Une organogenèse dynamique et structurée
Vue d’avion
Cinétique sur 65h
Acquisition toutes
les 2h30
QuickTime™ et un
décompresseur TIFF
sont requis pour visionner cette image.
Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités
cellulaires du MAC
SHOOT MERISTEMLESS
WUSCHEL
LEAFY
AINTEGUMENTA
CLAVATA1
CLAVATA3
ATML1
CUP-SHAPED COTYLEDONS
pANT:GFP, un marqueur de l’initiation et de la mise en
place des primordia foliaires
pANT:GFP
Coloration vitale + pANT::GFP
Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
pANT:GFP
T = 0h
T = 32h
T = 24h
T = 48h
Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
après le recrutement : prolifération cellulaire
Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D
Une disposition en spirale prédictible
P0
P5
P3
P6
P2
P1
P7
P4
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
L’auxine, une phytohormone transportée de façon polarisée, est
impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie
Transport polarisé de l’auxine (AIA):
Localisation des transporteurs à l’aide de FPs
1
1
(membrane apicale)
Sens du TPA
AIAH
AUX
H++ AIA-
2
pAUX1:AUX1::YFP
3
2
1
PIN
Transporteur d’efflux
(membrane basale)
2
AIAH
3
Transporteur d’influx
3
pPIN1:PIN1::GFP
Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des
flux d’auxine (DR5:GFP)
pDR5:GFP
Un senseur transcriptionnel de l’auxine
(pDR5 : 9 x AuxREs)
Auxine
P0
P2
Gradients locaux d’auxine par pompage
P3
P1
Interaction entre deux protéines
Mesure de l’interaction entre deux protéines par
"Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET)
D
GFP
D A
A
RFP
1- Compatibilité spectrale des fluorochromes
2- Proximité moléculaire des fluorochromes
Co-localisation de deux protéines…
Application de la technology FRET au vivant :
la protéine caméléon, un biosenseur du calcium
Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C.
elegans
[Ca2+] nulle
Excitation 440 nm
CFP séparée de YFP
(pas de FRET)
[Ca2+] faible
YFP/CFP faible
(peu de FRET)
QuickTime™ et un
décompresseur Video
sont requis pour visionner cette image.
[Ca2+] forte
YFP/CFP élevé
(FRET max)
Exemples d’application de la technologie GFP
Quelques limites
- Profil d’expression de gènes
- Etude fonctionnelle de protéines
- Biosenseurs
Localisation subcellulaire
Mouvement
Interaction protéine-protéine
(FRET)
Limites :
- Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés)
- Ajout d’une protéine (encombrement, environnement bio)
- Panoplie de FPs encore limitée
LHP1::GFP
QuickTime™ et un
décompresseur Video
sont requis pour visionner cette image.
Principe de transformation génétique stable chez les plantes
Début de floraison
Transformation de la lignée germinale
Sélection des transformants à
partir des graines
Etapes de
développement
In situ “digitale” des différents types cellulaires de la racine
Assises
cellulaires