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第七章 原核基因表达调控 §7.1 概述 §7.2 乳糖操纵子 §7.3 色氨酸操纵子 §7.4 其他操纵子 §7.5 转录后调控 §7.1 概述 原核生物 适应性，应变能力强，适应变化莫测的环境 细菌迅速合成自身需要的蛋白质、核酸、其他 大分子 迅速停止合成和降解不再需要的成分 真核细胞 多细胞有机体，不同类型的细胞合成蛋白质质 和量上是不同的 都有准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制 有的蛋白质数目固定： 代谢过程必需的，不受环境变化的 （DNA聚合酶，RNA聚合酶，糖酵解体系的酶） 组成型（Constitutive）合成蛋白质 有的蛋白变化很大： 蛋白质的合成速率明显受环境的影响而改变 (糖代谢的酶，氨基酸，核苷酸合成系统的酶） 适应型（adaptive )或调节型(regulated) 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中 持续表达，通常被称为管家基因 (housekeeping gene)。 基因表达（gene expression): 科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因 表达。 基因表达调控（gene regulation or gene control) 基因控制（gene control)： 对这个过程的调节 rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达 基因表达调控主要表 现在两个方面 转录水平上的调控 （transcriptional regulation) 转录后水平上的调控 (posttranscriptional regulation) 基因表达调控主要表现在两个方面 转录水平上的调控（transcriptional regulation) 任何一系列连锁过程，控制其第一步是最经济和 有效的。 转录后水平上的调控(post-transcriptional regulation) mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript) 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA) 正控制与负控制 正负控制如何定义 根据没有调节蛋白质存在的情况下，操纵子对 于新加入的调节蛋白质的响应情况来定义 负控制系统（negative control) 在没有调节蛋白质存在时，基因是表达的；加 人这种调节蛋白质后，基因表达活性便被关闭 调节蛋白 阻遏蛋白（repressor) In negative control, a trans-acting repressor binds to the cis-acting operator to turn off transcription. In prokaryotes, multiple genes are controlled coordinately. 正控制概念 正负控制如何定义 根据没有调节蛋白质存在的情况下，操纵子对 于新加入的调节蛋白质的响应情况来定义 正控制系统(positive control) 在没有调节蛋白质存在时，基因是关闭的，加 人这种调节蛋白质后，基因表达活性便被开启 调节蛋白 激活蛋白（activator) In positive control, trans-acting factors must bind to cis-acting sites in order for RNA polymerase to initiate transcription at the promoter. In a eukaryotic system, a structural gene is controlled individually. 基本概念 根据操纵元对于调节它们表达的小分子的应答反应的性 质来定义可诱导和可阻遏操纵元 可诱导操纵元（inducible operon) 诱导（induction)：加入对于表达有调节作用的小分 子后，开启基因的转录活性 诱导物（inducer)：产生诱导作用的小分子物质 可阻遏操纵元(repressible operon) 阻遏（repression)：加入对于表达有调节作用的小分 子物质后，关闭基因的转录活性 辅阻遏物（corepressor):产生阻遏作用的小分子物质 无论正，负控制，都可以通过 调节蛋白质与小分子物质的相互作用 达到诱导状态和阻遏状态 当诱导物钝化了阻 遏蛋白，为负控诱 导； 当诱导物活化了非 活性激活蛋白，为 正控诱导； 当辅阻遏物活化了 非活性的阻遏蛋白， 为负控阻遏； 当辅阻遏物钝化了 活性激活蛋白，为 正控阻遏。 §7.1 概述 §7.2 乳糖操纵子 §7.3 色氨酸操纵子 §7.4 其他操纵子 §7.5 转录后调控 §7.2 乳糖操纵子 Francois Jacob (1920~ ) Jacques Lucien Monod (1910~1976) 1965年他们和Andre Lwoff一起分享了诺贝尔生理医学奖。 Davies J, Jacob F., Genetic mapping of the regulator and operator genes of the lac operon. J Mol Biol. 1968 Sep 28;36(3):413-7. §7.2.1 乳糖（lac）操纵子结构 §7.2.2 lac操纵子模型主要内容 §7.2.3 lac操纵子本底组成型合成 §7.2.4 lac模型总结 §7.2.5 葡萄糖效应 乳糖(lac)操纵子结构 启动子 promoter（P） 调节基因 lac I 操纵区 operator（O） 结构基因 lacZ, lacY, lacA 操纵子的定义 操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵 基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组 成。操纵基因受调节基因产物的控制。 Repressor protein lac I-阻遏蛋白 lac Z- - lacY-乳糖透过酶 , lac A -乙酰转移酶 半乳糖苷酶 阻遏蛋白与操纵子的相互作用 操纵位点的回文序列（The lac operator has a symmetrical sequence） 阻遏蛋白结合位点： 它是从-5 至+21 的26 个，以+11位对称轴，TGTGTG和 AATTGT。 阻遏蛋白：分子量38KD， 由四个相同的亚基组成的 四聚体。 阻遏蛋白的结构： • 头部片段(Headpiece）： N 端1～59aa，为HTH (螺旋转角-螺旋)，与操纵基因 DNA的大沟结合； • 核心区：两个α螺旋夹着有 6个折叠，诱导物就结合 在两个核心区之间的裂缝 中； • C端为α螺旋，四个亚基的 螺旋链在一起，维持阻遏 蛋白的四聚体结构。 The structure of a monomer of Lac repressor identifies several independent domains. Photograph kindly provided by Mitchell Lewis. 阻遏蛋白单体的结构 Helix-turn-helix 1 51 DNA binding Hinge Core domain1 Core domain2 80 360 Inducer binding Oligomerization 图 16- 阻遏蛋白单体的结构和功能 operator repressor 阻遏蛋白(repressor proteins)与操纵区 （operator）相结合 lacZ编码- 半乳糖苷酶（-galactosidase） •将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖 •把乳糖转化为异乳糖。 lacY编码乳糖透过酶（Lactose permease） •运送乳糖过细胞质膜 lacA编码乙酰转移酶（Transacetylase） •把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到- 半乳糖苷上，形成 乙酰半乳糖。它在乳糖降解中不起作用。 -galactosidase -galactosidase 乳糖 §7.2.1 乳糖（lac）操纵子结构 §7.2.2 lac操纵子模型主要内容 §7.2.3 lac操纵子本底组成型合成 §7.2.4 lac模型总结 §7.2.5 葡萄糖效应 培养基中没有乳糖时，lac 操纵子的功能 阻遏蛋白 lacI为组成型转录，受启动子（弱）强度影响。 lacZ, lacY, lacA受调节蛋白的影响，阻遏蛋白 operator相结 合，从而阻碍了lac操纵子的转录。 培养基中含有乳糖时，lac 操纵子的功能: 当细胞内有 诱导物存在时， 诱导物以极高的 浓度与阻遏蛋白 结合，从而改变 阻遏蛋白的构象， 使之迅速地从操 纵子上解离下来。 这样，RNA聚合 酶就能开始转录 lac ZYA结构基 因。 别构调控（Allosteric control) 它有两个结合位点，一个是操纵基因结合位 点，另一个是诱导物结合位点。 当诱导物与它的结合位点结合，改变了阻遏 蛋白的构型，从而影响了操纵基因结合位点的活 性。 在蛋白质一个位点的相互作用而影响另一位 点的活性的调控称为别构调控（Allosteric control) LacI 基因正好与结构基因相邻，但它不与结构基 因属同一转录单位(Transcription unit)，它有自己独 立的转录单位，含自己的启动子和终止子。 LacI编码可扩散的产物，理论上它不必位于结构 基因的附近，它移到其它任何地方或作为一个DNA 分子片段都能很好地发挥作用 lacI 基因转录是组成型的，不受任何阻遏蛋白的 控制，而只受启动子强度的控制。实际上，它是由 弱启动子控制的。 可诱导操纵子（inducible operon)： • 诱导（induction)： 加入对于表达有调节作用的小分子后，开 启基因的转录活性。 • 诱导物（inducer)： 产生诱导作用的小分子物质。 可诱导的操纵子的一般规律： 1. 这类操纵子的基因所编码的蛋白质总是分解糖和 氨基酸的； 2. 这些操纵子常常是关闭的，必要时才打开。 为什么？ 细菌总是利用更一般的能源物质-葡萄糖的水解 来提供能量，因此这些操纵子常常是关闭的。一 旦生存条件发生变化，如葡萄糖发生缺乏而必须 利用乳糖作为能源时，就能打开这些基因。 安慰诱导物（gratuitous inducer）： 对于β-半乳糖苷酶来说，除了能被该酶分解的 半乳糖苷（如乳糖）可以作为诱导物外，一些能被 该酶识别但不能被分解的半乳糖苷化合物也能作为 诱导物。 如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropylthiogalactoside，IPTG），因为IPTG有 极强的诱导效应，而本身又不被分解，因而被称为 安慰诱导物。 CH2OH HO CH3 O S－C－CH3 H OH CH3 H H H H OH 图 16-6 异丙基-β-硫代半乳糖苷的分子结构 思考问题 在培养基中，即有葡萄糖又有乳糖，lac操 纵子是“off”还是“on”? 过了一段时间，lac操纵子将会可能有怎么 样的变化？ §7.2.1 乳糖（lac）操纵子结构 §7.2.2 lac操纵子模型主要内容 §7.2.3 lac操纵子本底组成型合成 §7.2.4 lac模型总结 §7.2.5 葡萄糖效应 两个矛盾 第一个矛盾： 诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转 运诱导物需要lacY基因表达产生的透过酶；透过酶 的产生又需要诱导物的诱导。 解释： 某些诱导物可以在没有透过酶的情况下穿过细胞 膜进入细胞； 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成。 两个矛盾 第二个矛盾： 乳糖并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是 乳糖的异构体——异构乳糖，而后者是在β-半 乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。 解释： 一些β-半乳糖苷酶可以在没有诱导物的情况 下合成。 本底组成型合成（background constitutive synthesis)： 在非诱导状态下有少量的lac mRNA的合成，这 种合成被称之为本底水平的组成型合成。 机理： 阻遏蛋白与lacO的结合并非是经久不变的，偶 而也会掉下来，RNA聚合酶就抓住这一时机进行一 次转录。并翻译出β-半乳糖苷酶， β-半乳糖苷透性 酶，半乳糖苷转乙酰酶。 在不含乳糖的培 养基中，lac+基因型 大肠杆菌细胞内β-半 乳糖苷酶和透过酶的 浓度低，每个细胞内 大约只有1-2个酶分子。 如果培养基中加 入乳糖，酶的浓度很 快达到细胞总蛋白量 的6%或7%。每个细胞 内可有超过105个酶分 子。 §7.2.1 乳糖（lac）操纵子结构 §7.2.2 lac操纵子模型主要内容 §7.2.3 lac操纵子本底组成型合成 §7.2.4 lac模型总结 §7.2.5 葡萄糖效应 Jacob-Monod 大肠杆菌 lac 操纵子模型(总结): 1. 操纵子是一簇基因，其表达受阻遏蛋白与操纵区互作； 2. lac I 基因有自己的弱启动子和终止子；lac I 阻遏蛋白 总是以较低的浓度存在。 阻遏蛋白是四聚物(4 polypeptides)； 阻遏物结合到O区并阻止RNA聚合酶进行的转录起 始； 结合并不完全，因此lacZ, lacY, 和lacA蛋白总能 以较低的水平合成（本底水平表达）； Jacob-Monod 大肠杆菌 lac 操纵子模型(总结续): 3. lac 操纵子一般处于负调控状态(即在诱导物缺乏 的条件下，lacI 抑制了RNA聚合酶的转录). 4. 培养基中有乳糖时，-galactosidase 把乳糖转 化为异乳糖 异乳糖与阻遏蛋白相结合，使阻遏蛋白的构 象发生改变，从而不能与操纵区相结合； 异乳糖诱导了lac 操纵子的正常表达. Jacob-Monod 大肠杆菌 lac 操纵子模型(总结续): 5. RNA 聚合酶开始进行多顺反子mRNA的转录 合成，该mRNA含有lacZ, lacY, 和 lacA 三 个基因； 6. mRNA 作为单个分子在核糖体上被翻译； 7. 乳糖被消耗尽后，阻遏蛋白又与操纵区相结 合，操纵子处于“off”状态。 思考问题： I-突变体：阻遏蛋白不能与操纵区结合的突变， 那么该操纵子变为？ Is突变体：阻遏蛋白不能与诱导物结合的突变 那么该操纵子变为？ 如果lacI 的启动子突变为强启动子， 那么这个lac操纵子？ Active repressor cannot bind to O c mutant operantor Operon is transcribed and translated lacI O c operantor β-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰转移酶 图 16-7 操纵基因发生组成型突变，操纵子组成型表达 Inactive repressor lacI － gene sythesizes defective repressor that does not bind to DNA lacI－ Operon is transcribed and translated Operantor β-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰转移酶 图 16- lac I 发生突变，操纵子组成型表达 Inactive repressor lacI－ Operator lacI － genesythesizes defective repressor that does not bind to DNA LacI + gene sythesizes wild-type repressor which bind to operator lacI + Inducer displaces wild-type repressor from operator as usual 图 16- Constitutive mutations in the lacI gene are recessive. §7.2.1 乳糖（lac）操纵子结构 §7.2.2 lac操纵子模型主要内容 §7.2.3 lac操纵子本底组成型合成 §7.2.4 lac模型总结 §7.2.5 葡萄糖效应 1. cAMP与CAP Cyclic AMP has a single phosphate group connected to both the 3’ and 5 ’ positions of the sugar ring. 2. 代谢物激活蛋白 (Catabolite activator protein)，CAP Crp基因编码代谢物激活蛋白（CAP），它 可以与cAMP形成复合物。 cAMP-CAP复合物是激活lac的重要部分，细 菌对于此复合物的需要是独立的，与阻遏体系无 关。 cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因 子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调 控体系作用下实现的。 3. lac 操纵子 中CAP导致 的正调控 cAMP-CAP复合物于 启动子的结合是lac mRNA合成起始所必需 的，这个复合物结合到 启动子的上游，能使 DNA双螺旋发生弯曲， 有利于形成稳定的开放 型启动子-RNA聚合酶结 构。而阻遏蛋白是一个 抗解链蛋白，阻止形成 开放结构，从而抑制 RNA聚合酶的功能。 4.葡萄糖效应 葡萄糖的存 在会抑制cAMP 活性，减少 cAMP的合成， 因此，CAP无 法与cAMP形成 复合物。 4.葡萄糖效应 研究发现，糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与 甘油之间的某些代谢产物是cAMP活性的抑制剂。 因此，葡萄糖效应又叫降解物的抑制作用（代谢物 阻遏效应catabolite repression）。 只要有葡萄糖的存在，这些操纵子都不表达， 这样的操纵子成为降解物敏感型操纵子（catabolite sensitive operon) 协调调节 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用 如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合， 操纵子仍无转录活性。 cAMP—CAP复合物与启动 子区的结合是转录起始所必需的。 The Lac Operon: When Lactose Is Present But Not Glucose Hey man, I’m constitutive Repressor CAP Binding CAP Bind to me Polymerase Yipee…! RNA Operator Promoter Pol. cAMP X Repressor mRNA LacZ RNA LacA Pol. LacY Repressor CAP cAMP Repressor Repressor This lactose has bent me out of shape cAMP CAP The Lac Operon: When Glucose Is Present But Not Lactose Come on, let me through Hey man, I’m constitutive Repressor CAP Binding Repressor mRNA Repressor RNA Operator Promoter Pol. LacZ LacY Repressor No way Jose! CAP LacA The Lac Operon: When Neither Lactose Nor Glucose Is Present Hey man, I’m constitutive Repressor CAP Binding CAP Bind to me Polymerase RNA Pol. Alright, I’m off to the races . . . Come on, let me through! Promoter Operator LacZ LacY LacA Repressor cAMP Repressor mRNA Repressor STOP Right there Polymerase CAP cAMP cAMP CAP 可诱导的操纵子的一般规律： 1. 这类操纵子的基因所编码的蛋白质总是分 解糖和氨基酸的； 2. 这些操纵子常常是关闭的，必要时才打开。 可诱导操纵元（inducible operon) 诱导（induction)：加入对于表达有调节 作用的小分子后，开启基因的转录活性 诱导物（inducer)：产生诱导作用的小 分子物质 可阻遏操纵子 细菌中还有负责某些物质合成的操纵子。比如负 责氨基酸合成的操纵子。 在没有外源氨基酸时，这类操纵子表达，使细胞 内有足够的氨基酸以进行蛋白质合成。 在有外源氨基酸存在时，那么细胞会利用现成的 氨氨酸而不用费力去合成.这类操纵子就受到阻遏。 这类被最终合成产物所阻遏的操纵子叫做可阻遏 操纵子。 可阻遏操纵元(repressible operon) 阻遏（repression)：加入对于表达有调 节作用的小分子物质后，关闭基因的转录活 性 辅阻遏物（corepressor):产生阻遏作用的 小分子物质 §7.1 概述 §7.2 乳糖操纵子 §7.3 色氨酸操纵子 §7.4 其他操纵子 §7.5 转录后调控 转录暂停位点 转录终止位点 操纵区 弱化子 前导区 Charles Yanofsky 等首次提出了 trp 操纵子 : trp 操纵子横跨 ~7kb ，含产生 5 个色氨酸合成所需的 基因； trp 操纵子含有5个编码基因，即 trpA-E； 启动子和操纵区位于trpE 的上游； trpA-E 编码基因和操纵区之间是前导序列 (trpL)； 在 trpL 内有一个弱化子 (trpa)； 启动子上游是阻遏蛋白基因（trpR）。 色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子有5个连续排列的结构基因，编码使 分枝酸转化为色氨酸的酶基因。 trpE：编码邻氨基苯甲酸合成酶； trpD：编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶； trpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶； trpB：编码色氨酸合成酶的亚基； trpA：编码色氨酸合成酶的亚基。 trp 操纵子的调节有两种机制: 1. 阻遏系统 粗开关 主管转录是否启动 2. 弱化作用（attenuation) 细调开关 主管已经启动的转录是否继续下去。 1.阻遏系统（粗调控） 当培养基中色氨酸含量较高时，它与 trpR 基因产 物（阻遏物-repressor）相结合,并使之与操纵区 DNA紧密结合，阻止转录进行. 抑制作用可导致操纵子的转录水平降低约70- 倍. 当培养基中色氨酸供应不足时，阻遏物失去色氨酸 并从操纵区解离，色氨酸操纵子去阻遏。 trp操纵子的阻遏系统 阻遏蛋白产生 阻遏蛋白失活 操纵区“on” 2. 弱化作用 前导区（trpL) 在trp mRNA5’端trp E基因的起始密码前有一个长162bp 的mRNA片段，称为前导区。 前导肽： 前导序列中，发现有起始密码子AUG和终止密码子UGA。 如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。 特点：前导肽中在其第10和11位上有相邻的两个色氨酸 密码子。 弱化子(trpa)： 其中的123-150区为弱化子。转录终止发生在这一区域。 色氨酸操纵子的结构 前导区有两种碱基配对方式。 1-2，3-4：形成终止构型 2-3：成功通读 2. 弱化作用 转录也受弱化子控制，翻译出的是一条短的、不完 整的多肽. 当细胞处于色氨酸饥饿状态时，trp 基因大量表达. 在色氨酸饥饿状态缓解时，trp 基因的表达水平也 相对降低. 色氨酸浓度很低时: 1. 负载有Trp的Trp-tRNAs 就少, 核糖体通过Trp 密码子的速度 就会很慢，从而覆盖了前导肽的1区. 2. 此时1区不能和2区配对，所以2区和3区在转录完成后配对. 3. 此时和2区配对的3区在4区转录完成后，不能形成3－4区配对. 4. 此时RNA聚合酶继续转录4区，完成整条trp mRNA的合成. 色氨酸浓度较高时: 1. 核糖体不在 trp 密码子处停留，继续翻译前导肽，在2 区终止. 2. 此时2区不能和3区配对，导致3区和4区配对. 3. 3区和4区配对是一个弱化子序列，发出一个终止信号. 4. 转录在还没到达trp基因时就被终止. 色氨酸浓度 很低时: 色氨酸浓度 较高时 • 阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少 • 弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸 的tRNA的多少。它是通过前导肽的翻译 来控制转录的进行。 为什么要有弱化系统？ 细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻 遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只 能通过弱化作用使之中途停下来。 为什么要有阻遏系统？ 是在有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先 导mRNA的合成，它使这个系统更加经济 这两种机制都是为了避免浪费，提高效率。在细 胞内，这两种作用是相辅相成的，体现着生物体内周 密的调控作用 Trp操纵子弱化机制的实验依据 Trp-tRNA合成酶的活性受温度控制， 30℃度-有活性 42℃度-无活性 假设外界含有相对较高浓度的色氨酸 那么，如果在30℃条件下，该trp操纵子是否继续 转录？ 如果在42℃条件下，该操纵子是否继续转录？ Trp操纵子弱化机制的实验依据 如果将前导序列缺失，那么该trp操纵 子的表达高还是低？ 如果前导肽永远形成1-2、3-4配对结构， 那么该操纵子对于氨基酸的饥饿是否有响应？ 弱化子的普遍性及其生物学意义 许多负责氨基酸合成的操纵子都受到弱化子 的调控。 在前导肽的mRNA 中，具有比trp操纵子前 导肽多得多的连续的相应氨基酸的密码子。 在某些操纵子中，弱化子可以对不止一种氨 基酸饥饿作出反应。 大肠杆菌苯丙氨酸(Phe), 组氨酸(His), 亮氨酸(Leu), 苏氨 酸(Thr), 和 异亮氨酸(Ile)操纵子中前导肽的氨基酸序列 前导肽中都富含操纵子所合成的那种氨基酸。 §7.1 概述 §7.2 乳糖操纵子 §7.3 色氨酸操纵子 §7.4 其他操纵子 §7.5 转录后调控 一、半乳糖操纵子(galactose operon) 异构酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT) 半乳糖激酶(galk)。 gal操纵子的特点： ① 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开 始转录； ② 它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因 galE内部。 当无葡萄糖（ cAMP-CAP存在）时，RNA聚合酶与 galP1结合，以S1为转录起始点； 当有葡萄糖（无cAMP-CAP）时，RNA聚合酶与galP2 结合，以S2为转录起始点； 原因： cAMP-CAP结合区和RNA聚合酶结合区 部分重叠， 这两种蛋白质的相互作用，刚好适合于RNA聚合酶结合 于galP1的框，从而在S1处起始转录； 由于galP2太靠近cAMP-CAP结合区，而cAMP-CAP 的结合会使DNA构型变化，就防碍了RNA聚合酶结合到 galP2上。 二、阿拉伯糖操纵子 （arabinose operon) • araB基因、araA基因和araD, 形成 一个基因簇，简写为araBAD ara操纵子的调控有两个特点： • 第一，araC表达受到AraC的自身调控。 • 第二，AraC既是ara操纵子的正调节蛋白（需cAMPCRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。 这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现 的（Pi和Pr)。 体系中葡萄糖水平较高，阿拉伯糖水平较低时： 体系中有阿拉伯糖但无葡萄糖存在时： 三 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答 SOS诱导型DNA修复系统： 当细菌DNA遭到破坏时，细菌细胞内会启动这 个修复系统。 该系统的多个基因： 分散在染色体的各个部分，但受到LexA阻遏 蛋白的抑制。 该系统的诱导表达过程： 把阻遏蛋白从这些基因上游调控区移开的过 程。 该系统的多个基因： 分散在染色体的各个部分，但受到LexA阻遏蛋白 的抑制。 该系统的诱导表达过程： 把阻遏蛋白从这些基因上游调控区移开的过程。 当DNA严重受损时，DNA复制被中断，单链DNA缺 口数量增加，RecA与这些缺口处单链DNA相结合，被 激活成为蛋白酶，将LexA切割，使其没有阻遏活性， 于是导致SOS体系高效表达，DNA得到修复。 当修复完成后，活化信号消失， RecA蛋白又回到非蛋白水解酶的形式， LexA蛋白才逐渐积累起来，并重新建 立阻遏作用． 四 二组分调控系统和信号转导 • 传感蛋白 （sensor protein) • 应答调节蛋白 （response regulator protein) 五 多启动子调控的操纵子 rRNA操纵子(rrnE)上有两个启动子（P1，P2） P1，强启动子 P2，弱启动子， 当细菌处于紧急状态时，细胞中ppGpp浓度 增加，P1的作用被抑制。 那么这个时候由p2起始该操纵子的转录。 核糖体蛋白SI操纵子（rpsA) DnaQ蛋白操纵子 §7.1 概述 §7.2 乳糖操纵子 §7.3 色氨酸操纵子 §7.4 其他操纵子 §7.5 转录后调控 转录后调控 1. mRNA自身结构元件对翻译起始的调控 2. mRNA稳定性对翻译水平的影响 3. 调节蛋白的调控作用 4. 反义RNA的调节作用 5. 稀有密码子对翻译的调控 6. 重叠基因对翻译的影响 7. 翻译的阻遏 8. 魔斑核苷酸水平对翻译的影响 1. mRNA自身结构元件对翻译起始的调控 RBS的结合强度 取决于SD序列的结构及其与起始密 码AUG之间的距离。SD与AUG之间距离 一般以4-10个核苷酸为佳，9个是最佳的。 mRNA的二级结构(举例） 影响核糖体与mRNA的结合，从而造 成了蛋白质合成效率上的差异。 RBS：起始密码子AUG上游的一段非翻译区。 “30S 核糖体小亚基与起始因子IF –1和IF-3相 结合，通过SD序列与mRNA模板相结合”。 mRNA的二级结构- Qβ噬菌体 • E.coli的RNA噬菌体MS2 ，R17，f2和Qβ都非常 小（直径约为250），是最简单的病毒。基因组 长3600～4200nt，只含4个基因：A、cp、Rep和 Lys。 • CP(coat protein) 编码外壳蛋白 多 • A（atachment）编码附着蛋白 少 • Rep（replicase）编码复制酶 中 • lys（lysis） 编码裂解蛋白 CP Rep A 5’ 3’ 开放的 A 位点 当以(－)链为模板 复制时,A 位点瞬 时开放，可翻译 一个分子 5’ 3’ A Replicase CP 在三个位点中仅 CP 是开放的，CP 翻译时使下游的 Rep 打开，才能得 以翻译 5’ Rep 5’ 3’ 图 16- R17 噬菌体利用二级结构对翻译进行调控 CP 蛋白也可结合 于 Rep 位点，使 细胞中 CP 含量比 Rep 多 一个RNA噬菌体基因组进入宿主细胞 后，核糖体仅附着到cp基因开始的核糖体 结合位点上，而不附着到A蛋白基因或rep 基因的开始处，因为它们的核糖体结合位 点被病毒RNA的二级结构所保护。相比之 下，CP蛋白的起始密码子AUG处被核糖 体所附着，因它曝露在二级结构的未端 由于A和rep两个位点被封闭在二级结 构中，首先打开的是cp位点。 当核糖体阅读到cp位点时，使形成 二级结构的氢链断裂。随着翻译的进行， 将其下游的rep位点也冲开了。这样rep 基因总是依赖于位于前面的cp位点和核 糖体的结合。 虽然rep的核糖体结合位点每次都被cp基 因的翻译所打开，但是RNA噬菌体的cp蛋白 多肽链产生的量要比复制酶多得多，为什么？ 新产生的外壳蛋白的亚基可以特异地附 着到rep基因的核糖体结合位点，阻止了核 糖体的附着。这样外壳蛋白就成了复制酶基 因翻译的特异阻遏物。 在感染10分钟后，外壳蛋白足以阻断复制 酶的进一步合成。 A蛋白的翻译正是趁以负链为模板 开始复制时，新合成的“＋”链在尚 未形成二级结构之前核糖体结合到其A 位点上，进行翻译，产生A蛋白。 2. mRNA稳定性对翻译水平的影响 • 降解mRNA的酶都是3‘-5’外切核酸酶， 但mRNA的二级结构可以阻遏这些酶的 作用 • IR（反向重复顺序）的存在可以防止3-5 外切核酸酶的降解作用 • 在malE3‘端有IR存在，可以形成茎环保护 其不被外切核酸酶所降解 • 因此，malE产物比malG，F产物含量高。 麦芽糖操纵子与IR的位置 3. 调节蛋白的调控作用 也为：蛋白质合成的自体调控 （autogenous regulation) 蛋白质合成的自体调控 （autogenous regulation) 操纵子的表达都受操 纵子自身的一些基因产物 的调控。 当一个蛋白质调控自 身的产量时，就发生了自 体调控。 核糖体蛋白质是每个 操纵子的调控蛋白质。 自体调控物r-蛋白与 rRNA上结合位点结合的 程度比其他mRNA上结 合位点的程度强，所以 当存在游离rRNA时，最 新合成的r-蛋白与rRNA 结合开始装配核糖体。 此时没有游离的r-蛋白与 mRNA的结合， mRNA 的翻译继续； 一旦rRNA合成减慢或 停止，游离r-蛋白富集， 就能与他们的mRNA结合， 阻止其继续翻译 只要相对于rRNA有多 余的r-蛋白， r-蛋白 的合成就会被阻止。 也就是保证了核糖体 蛋白质的合成与rRNA的 合成几乎同步地停止。 蛋白可以结合到mRNA的靶区域 上阻止核糖体识别区以达到阻遏的 功能。 4. 反义RNA的调节作用 1983年，Mizuno等人发现了反义RNA对 于基因表达的调控作用，从而揭示了一种 新的基因表达调控的机制。 此前，基因的调控只有通过蛋白质与 核酸的相互作用而实现 而反义RNA的调控是核酸与核酸的相 互作用。 反义RNA（antisense RNA)通过互补的 碱基与特定的mRNA结合，结合位点通常是 mRNA上的SD序列，起始密码子AUG和部 分N端的密码子，从而抑制mRNA的翻译。 人们称这类RNA为干扰mRNA的互补RNA， 间称micRNA(mRNA-interfering complementary RNA) 调控RNA与阻遏操纵子的蛋白质的不同 点是RNA没有变构的性质，它不受其它小分 子影响而改变识别靶分子的能力。因此它的 调控作用随着其产生而形成，随着酶将其降 解而消失。 例子： 大肠杆菌外膜蛋白有两种，一种为ompC，一种为 ompF，OmpC和OmpF两个基因编码了OmpC和OmpF两 种外膜蛋白，这两个基因并不连锁，但却受到培养基的渗 透压的控制。它们的表达和渗透压改变有关。 在高渗透压时， ompC合成增多，ompF的合成受到抑 制。 在低渗透压时，ompF合成增多， ompC的合成受到抑 制。 它们如何对渗透压的改变作出反应呢？ EnvZ基因编码一种作为渗透压感受器的一种 受 体 蛋 白 。 当 渗 透 压 增 加 时 ， EnvZ 激 活 OmpR的产物（一种正调节蛋白）。它可以 激活OmpC和调节蛋白mic F两个基因转录。 micF 的产物是一条长174nt的RNA，称为micRNA （mRNA-interfering-complementary mRNA ）,即干 扰mRNA的互补RNA。一般都称之为反义RNA( anti sense RNA )。 MicF RNA可以和OmpF mRNA上包含核糖体结合位 点的翻译起始区互补结合，形成双链区。 MicF RNA 通过和OmpF mRNA的结合来作为一种 调节物并阻止其翻译。 当渗透压增加时会导致micRNA的合成，而关闭了O mpF mRNA的翻译。 micF RNA能 够与ompF mRNA 的前导序列中的44 个核苷酸（包括SD 序列）以及编码区 域（包括起始密码 子AUG）形成杂合 双链，从而抑制 ompF mRNA的翻 译。 反义RNA的概念可以用于研究基因的功能 反义RNA的 合成能抑制原核 基因或真核基因 的靶RNA。人工 合成的编码反义 RNA的基因已被 引入大肠杆菌中， 它们可通过与 mRNA互补阻止 特异靶基因的表 达。 5. 稀有密码子对翻译的调控 细胞内对应于稀有密码子的 tRNA较少，高频率使用这些密码子 的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋 白质的总量。 稀有的密码子，细胞中其相应的 tRNA含量很少，不易获得，这样就 延长了核糖体在mRNA上行经的时间， 从而降低了翻译的速度。 O rpsU 核糖体小亚基 上 S21 蛋白 4 万分子/细胞 dnaG 引物酶 50 拷贝/细胞 rpoD RNA 聚合酶的 σ亚基 2800 拷 贝/细胞 图 17－56 rpsU 操纵子中 3 个基产物的拷贝数完全不同 这三个基因连锁在同一操纵子上，它们产 物的量何以能差异如此之大？ 表 16-7 在不同产物中 Ile 密码子使用频率不同 在 25 种非调控蛋白中(%) 结构蛋白 在引物酶中(%) 在σ因子中(%) AUU 37 36 26 AUC 62 32 74 AUA 1 32 0 密码子 编码Ile的AUA（稀有密码子）在 dnaG基因中它占有的频率是32%，几 乎占了1/3，但细胞中其相应的tRNA 含量很少，不易获得，这样就延长了 核糖体在mRNA上行经的时间，从而 降低了翻译的速度。 rpoD基因正好与此相反，AUA的分布 频率为0，根本就不使用这个稀有密码子， 所以合成σ亚基不受其影响。而使用最多 的密码子AUC，其tRNA也是细胞中含量 最丰富的，正好可以满足其需要，因此其 产量可以高达2800个拷贝。 6. 重叠基因对翻译的影响 正常情况下，色氨酸操纵子5个基因产 物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trp D的产量比下游的trpBA产量要低得多。为 什么？ 研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基 因中核苷酸序列与翻译偶联的关系，发现 trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始 密码子共用一个核苷酸 TrpE-Thr-----Phe----终止 ACU—UUC—UGA—UGG--CU AUG---GCU Met----Ala---TrpD TrpB -Glu----- Ile------终止 GAA –AUC---- UGA----UGG---AA AUG----GAA Met------Glu---TrpA 当TrpE翻译终止时，核糖体尚未来得及解 离，已处于TrpD的起始密码子上，使翻译 偶联起来，这两个基因的彼此协调，而于 下游邻近的C基因就不存在这种翻译偶联的 关系。 TrpB和TrpA也同样以这种偶联的关系来协 调一致。 翻译偶联可能是保证两个基因产物在数量 上相等的重要手段 虽然galT的终止密码子与galK的起始密码子相隔3个核 苷酸， galK的SD序列却位于galT基因终止密码子之前。 但核糖体结合在mRNA上，可以覆盖40个核苷酸，包 括SD序列和galK基因的起始密码子，所以当galT翻译终止 时，核糖体还没有脱落就直接与SD序列结合，开始galK的 翻译，也能保证两个基因的等量翻译，也是一种翻译偶联。 7. 翻译的阻遏 Qβ噬菌体感染细菌，RNA进入细胞后，这 条称为（+）链的RNA立即作为模板指导合 成复制酶，并与宿主中已有的亚基结合行 使复制功能。 但是， Qβ （+） RNA链上此时已有不少核 糖体，它们从5‘-3’方向进行翻译，这无疑 影响了复制酶催化的从3‘-5’方向进行的（-） 链的合成。 克服这个矛盾的办法就是由Qβ复 制酶作为翻译的阻遏物进行调节 复制酶可以和外壳蛋白的翻译起始区结 合，这样核糖体便不能与起始区结合，但 已经起始的翻译仍能继续下去，直到翻译 完毕。核糖体脱落，与（+）RNA3’端结合 的复制酶便开始了RNA的复制。 8. 魔斑核苷酸水平对翻译的影响 应急反应（stringent response)： 当细菌在不良的营养条件下生长时，由于缺乏 足够的氨基酸，蛋白质合成受到抑制，并由此影响 到细胞的许多生理生化活性，代谢水平下降，生长 速度变慢。细菌对于不良的营养条件所产生的这一 系列的反应叫做严谨反应。 rRNA和tRNA的合成大量减少10-20倍 部分种类的mRNA合成减少 蛋白质降解速度加快，核苷酸、糖和脂类的合成 量下降。 细菌仅进行很少且有限的代谢过程以节 约使用有限的资源，当营养条件得到改善时， 细菌将停止这种应急调控，重新开放各代谢 过程。 应急反应引起两种异常核苷酸大量增加： ppGpp：鸟苷四磷酸 pppGpp：鸟苷五磷酸 有时候合写为(p)ppGpp 魔斑（magic spot)： 当大肠杆菌处于氨基酸饥饿时，在体 内出现两种异常的核苷酸，在薄层层析图 谱上的迁移率与常见的核苷酸不同，人们 称之为魔斑I和魔斑II。后来才知道，魔斑 I就是 ppGpp，魔斑II就是 pppGpp。 警报素（alarmone): ppGpp：鸟苷四磷酸 pppGpp：鸟苷五磷酸 有时候合写为(p)ppGpp cAMP(碳源不足的情况下） 应急因子催化产生警报素 relA基因编码的蛋白称为应急因子(Stringent factor)，焦磷酸转移酶，(p)ppGpp合成酶 由空载tRNA激活 应急反应的诱导物为空载tRNA RelA酶更多地利用 GTP为底物进行合成 反应，因此RelA的主 要产物是pppGpp。 然而pppGpp能经几 种酶转化为ppGpp。 pppGpp转化产生的 ppGpp是最常见的途 径。 在饥饿条件下，当氨基酰-tRNA不能对 A位点的密码子作出有效反应时，核糖 体便停滞不前。空载tRNA的进入，触 发了(p)ppGpp分子的合成。并将空载 tRNA排出，使A位重新空出来。核糖 体是恢复多肽的合成，还是进行另一 轮的空转反应,关键是取决于氨基酰tRNA是否有效。 当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp，可在很大 范围内做出如抑制核糖体和其他大分子合成的应 急反应，活化某些氨基酸操纵子的转录表达，抑 制与氨基酸转运无关的系统，活化蛋白水解酶等， 以节省或开发能源，度过难关。 (p)ppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只 影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以 它们是超级调控因子。 补充：DNA序列重排对基因转录的调控 沙门氏菌的鞭毛蛋白由两个不同的基因H1和H2编码。 H1基因表达-产生H1型鞭毛蛋白（细菌处于I相） H2基因表达-产生H2型鞭毛蛋白（细菌处于II相） 相变（phase variation)： 处于I相或II相的细菌在进行细胞分裂时，以 1/1000的频率产生另一相的后代，这个过程叫做相变 （phase variation) 负责合成两种鞭毛 的基因位于不同的染 色体座位。 H2基因是和另一个 编 码 H1 阻 遏 物 基 因 rh1紧密连锁。这两个 基因协同表达。 处于2相时，在H2 基因表达的同时，阻 遏物基因也得到表达, 且阻止了H1基因的合 成； 在1相时，H2基因 和rh1基因都不表达， 这样H1基因就进行合 成。 在此控制途径中， 细菌的相取决于H2rh1转录单位是否有活 性。 这个转录单位的活性 是由与它相邻接的一 个DNA片段来控制的。 此片段长995bp，两 端是长14bp的反向重 复 序 列 （ IRL 和 IRR）。 H2 的 起 始 密 码 子 在 反向重复序列IRR右 侧16bp处。 含有hin基因的DNA片段在IRL（左反向重复 序列）和IRR（右反向重复序列）之间，其产物 Hin（H segment inversion）蛋白通过反向重复 序列之间的交互重组来介导整个片段的倒位 H2-rh1转录单位的启动子位于倒位片段之中， 启动和转录单位方向相同时，转录在启动子处 起始，而且持续通过H2-rh1,导致2相的表达。 当Hin片段倒位时启动子和转录单位方向不同， 转录单位不能表达，从而导致了1相表达。 DNA序列重排 沙门菌鞭毛素基因的调节 hin P2 H2 ×è¶ô»ùÒò P1 H1 DNA H2±ÞëËØ HinÖØ×éø hin P2 תλƬ¶Î H2 ×è¶ô»ùÒò P1 H1 H1±ÞëËØ