Transcript MetaMorph软件简要使用说明

测钙和FRET系统
使用说明
目录
• MetaMorph软件简要使用说明
– 拍摄参数说明
– Timelapse拍摄
– 标尺
– 伪彩
• MetaFluor软件简要使用说明
– FURA2实验操作步骤
– FRET实验操作步骤
• OptoSplitII FRET双波长采集调节使用说明
• 滤光片配置
MetaFluor软件简要使用说明
1.启动MetaMorph软件
2.显微镜目镜下找到样品，然后切换光路，将光送至CCD
3.菜单Acquire→Acquire
①
②
⑤
③
④
①Acquire按钮：拍摄一张图像
②ExposureTime窗口：调节图像曝光时间，曝光时间越长，图像亮度越大
③Live按钮：预览图像
④More按钮：展开相机控制窗口
⑤EMGain滑动条：EMCCD电子增益，增益越大，图像亮度越高，建议300以内
MetaMorph软件-TimeLapse拍摄
• 调节好Acquire拍摄参数后，关闭Acquire窗口
• 菜单Acquire→Acquire Timelapse
①
②
①每张图像之间的拍摄间隔
②实验拍摄时间总时长
③电击OK按钮，开始
Timelapse拍摄
③
MetaMorph软件-标尺
菜单Measure→Calibrate Dstances…
①
②
①根据所用物镜选择倍率
②点选Apply，然后Close
放置标尺：
菜单Display→Graphics→Calibration Bar…
①标尺长度和厚度
②标尺颜色
③点击Stamp放置标尺在
图像上
③
①
②
③
MetaMorph软件-伪彩
点选图像左侧按钮
选择所需要的伪彩
颜色
MetaFluor软件-FURA2实验步骤
启动MetaFluor软件
点击New按钮，开始一个实验
①设置存盘文件
名和路径
②点选Cfg Exp，
设置拍摄流程
②
①
①
②
③
设置FURA2实验流程
①开启340和380
②开启Ratio1
③OK
①
⑤
③
①
①设置Timelapse，拍摄间隔和拍摄总张数,点击
④
②
focus调焦对准
②选择预览荧光通道（先340再380）
③预览图像，调节曝光时间和EMGain增益，
（调380EMGain和340一样，分别2次340.380调节）
先调EMGain在1000-2000之间，最高峰在2个之间
④点选Store for this保存拍摄参数
⑤关闭窗口
⑤
①
②
①点选Acq one，拍摄一套图像，包括340，380，Ratio各一
张
②点选Region，选择一张荧光用于ROI（感兴趣区域）测量
②
①
③
②
②
②
①选择圆形区域工具
②在图像上画出需要
分析的区域，数量
不限（后期数据分
析，每个区域的颜
色和曲线一一对
应）
③Done退出
②
③
②
②
③
①
①
②
③
④
⑤
⑥
点击Acquire开始拍摄实验
原始图像分别是：340图像，380图像，340和380 ROI时间-强度曲线
实验结果：Ratio1图像，Ratio1 ROI时间-强度曲线
点击f4停止
点close-点no-open-打开原始图-选点（用experiment control frame 找点 –带曲线稳定后2.5-5’后
加10mMCacl2200uL
选点：regin-ratio-DONE f4
MetaFluor软件-FRET实验步骤
①
②
②
③
①启动MetaFluor软件，点击New按钮，点击Cfg Exp设置实验流程
②开启CFP和YFP，Ratio1
③Ok退出
①菜单File→Preferences
②页签DualView
③激活DualView选项
④OK退出
⑤调节好OptoSplitII双色分光附件
（详细步骤见后面调试说明）
⑥软件使用和FURA2操作步骤一致
①
②
③
OptoSplitII
FRET双波长采集调节使用说明
OptoSplitII-FRET-双色荧光分光模式
①找出CFP/YFP激发块
②打开侧面盖板，抽出已有Cal校正激发块，将
①插入OptoSplitII中
③关好侧面盖板
①
②
①调节2个光阑
②使屏幕图像上下各遮挡1/4
③旋转Split旋钮，将图像左
右分开
④如右图。如图像位置不对
应，可调节V1，V2，H2旋
钮
①
④
③
③
注意：
FRET时，③位置应用②
全通模式时，③位置应用①
①
②
滤光片配置
• FURA2滤光片
– 激发：340/26，387/11（安装于DG4快速光源内）
– 发射：510/84（安装于显微镜荧光转盘6号位内）
• FRET CFP/YFP滤光片
– 激发：434/17（安装于显微镜荧光转盘5号位内）
– 发射：483/32，542/27（安装于OptoSplitSplitII内）
• 举例说明： 340/26，波长范围340±13nm，即
透过波长327-353nm