Transcript Využití průtokové cytometrie při mikrobiologické kontrole potravin

Využití průtokové cytometrie
při mikrobiologické kontrole
potravin
Stávající konvenční metody
Klasická
mikrobiologie
48 - 170 hod.
dle typu
+
Kvantitativní analýza
Suroviny
3 - 7 dnů
Zpracování
3 - 7 dnů
Konečný produkt
3 - 7 dnů
Alternativní metody v mikrobiologii
Více či méně citlivé rychlometody
používané ke kontrole potravin, nápojů,
vody, ve farmacii a kosmetickém průmyslu:
• Impedanční metoda
• ATP bioluminiscence
• Průtoková cytometrie
• Laserová cytometrie v pevné fázi
Alternativní metody v mikrobiologii
• ATP Luminiscence
• Průtoková cytometrie
• Laserová cytometrie
v pevné fázi
Adenosin-trifosfát (ATP)/bioluminiscence
Princip metody:
Všechny životaschopné buňky obsahují ATP
V přítomnosti substrátu D-luciferinu, kyslíku a
hořečnatých iontů, využívá enzym luciferása
energii z ATP, okysličuje D -luciferin a produkuje
světlo.
Množství vyprodukované bioluminiscence může
být měřeno citlivým luminometrem a je úměrné
množství ATP ve vzorku.
Citlivost mikrobiologických metod
108
106
105
104
103
Fáze růstu
(hodiny až dny)
1
102
1
Čas
ChemScan
D-Count
BactiFlow
Ostatní technologie
Agarové
misky
3- 14 dnů
Citlivost mikrobiologických metod
Metoda
Citlivost
metody
Doba potřebná
k získání
výsledku
Použití
Impedanční
105-106
48-72h
Screening
ATP
bioluminiscenc
e
Flow cytometry
(průtoková
cytometrie)
ChemScanRDI
(cytometrie v
pevné fázi)
103-104
24-48h
Screening /
(vyčíslení)
10 -103
1-24h
Screening /
vyčíslení
1
90 minut
Vyčíslení
Průtoková cytometrie
Výsledek za 24 hodin
=
Dnes vím, jak jsem vyráběl včera.
Výsledek za 90 minut
=
Dnes vím, jak dnes vyrábím.
Průtoková cytometrie a cytometrie v pevné fázi
Výsledek za 24 hodin
=
Je-li včerejší odběr dnes pozitivní, pak zítra budu
znát účinnost nápravných opatření.
Výsledek za 90 minut
=
Je-li dnešní odběr dnes pozitivní, pak dnes budu znát
obratem účinnost nápravných opatření.
Charakteristiky cytometrických metod
• Validovatelnost
• Vysoká citlivost
• Rychlost
• Univerzálnost (mibi vyšetření)
• Testy mikrobiálního znečištění
• Suroviny
• Mezioperační kontroly
• Voda
• Finální produkty
• Mikrobiologický monitoring prostředí
• Stěry
• Vzduch
Princip cytometrických metod
• Fluorescenční označování životaschopných
mikroorganismů
• Odečítání laserovým skenováním filtru, tzv.
Solid phase cytometr
- ChemScanRDI
• Odečítání označených buněk průtokovým
cytometrem s laserem a vyhodnocovací
celou
- BactiFlow ALS, BactiFlow, D-Count
FLUORASSURE® - metoda
Technologie fluorescenčního označování
Celkový počet
životaschopných
• Enzymatická aktivita
• Celistvost membrány
Enzymy
Volný fluorochrom
Bakterie
Specifický substrát
Identifikační testy
• Specifické enzymy
• Sondy nukleových kyselin
• Protilátky
Enzyme
Sondy nukleových kyselin
Protilátky
Označování mikroorganismů
Metoda fluorescenčního označování „Fluorassure“ byla ověřena na
více než 2000 mikrobiálních kmenech.
Vyhodnocení přítomnosti kvasinek a plísní ve vzorcích a dále test
sterility, stanovení CPM životaschopných, Enterobacteriaceae
Ze specifických mikroorganismů lze identifikovat a vyčíslit:
na D-Count a BactiFlow
• Salmonella
• Enterobacteriaceae
• Listeria - aplikace ve vývoji
na ChemScanRDI
• E.coli
• Celkový počet koliformů
• Cryptosporidium
• Giardia….
Vyhodnocení pomocí specifického software
- Počítačové vyhodnocení eliminuje lidské chyby v mikrobiální identifikaci a
vyčíslení
- Výběr mikroorganismů je založen na optickém a elektronickém zpracování
signálů
- 20 kritérií výběru mikroorganismu, mimo jiné:
- Barevné ohraničení
- Intenzita světla
- Tvar křivky
- Poměry barev
Colour Fingerprinting
Emisní spektrum fluorochromu
Intenzita
Zelený kanál
Červený kanál
Vlnová délka (nm)
ChemScanRDI®
Výsledek za 60 minut od odběru vzorku
Jediný systém umožňující detekci a vyčíslení mikroorganismů ve filtrovatelných
vzorcích,
ve vzduchu a stěrech v reálném čase
a s citlivostí od jednoho mikroorganismu.
ChemScan RDI – pracovní postup
Membránová filtrace vzorku
= zachycení mikrobů
na membráně
Označení životaschopných
buněk
Laserové skenování a
vyhodnocení
Analyzní protokol pro TVC
1. FILTRACE
2. OZNAČENÍ
3. LASEROVÉ SKENOVÁNÍ
Filtrace
vzorku
Předoznačení
60
min - 90 min - 120 min
Označení
30 min
Transfer filtru
Podložka nasycená
předvzorkovací reagencií
Podložka
saturovaná
vzorkovacím
roztokem
ChemScan RDI ™
odečítací analýza
Validace a potvrzení výsledků zabudovaným
mikroskopem
D-Count – BactiFlow ALS:cytometrie průtoková
Mikroorganismus
Označení buněk
Životaschopný
substrát
Enzym
12 minut
Volný fluorochrom
Označený vzorek
Počítání buněk
Detektor
1 minuta
Laser
Detektor
BactiFlow ALS
• Technologie stejná jako D-Count pouze poloviční počet
vzorků v jedné šarži
• Na rozdíl od BactiFlow je BactiFlow ALS v plně
automatickém provedení
D-Count x BactiFlow ALS



Spolehlivé rozlišení mikroorganismů od ostatních částic

použitelné pro širokou řadu produktů

vysoká citlivost
Okamžité zobrazení počtu buněk

bez nutnosti interpretace dat

snadná čitelnost dispeje
Absolutní dohledatelnost dat

snadná validace
D-Count–BactiFlow ALS
Porovnání s kultivační
metodou
Produkty očkované < 10 c.f.u./ umístěné v nádobách
& inkubované 24 h při 30 °C
1,00E+07
D-Count
Kultivační metoda
1,00E+06
Počet/ gram
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
Stap aureus / Bacillus cereus / Bacillus cereus /
Enterobacter /
E. coli /
Leuconostoc /
Čokoládový Vanilkový dezert Čokoládový Vanilkový dezert Čokoládový Vanilkový dezert
dezert
dezert
dezert
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Konečný produkt
přímé počítání
 test pozitivity/negativity

HACCP
suroviny
TVC

technologická
voda

mezioperační
Salmonella
Enterobakteriacea
Listeria…

kvasinky & plísně
kontrola

směr vývoje
Hygienické kontroly

prostředí

personál
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Proaktivní kontrola výroby (HACCP)
•
•
•
•
Použitelnost detekce:
- celkový počet životaschopných organismů (TVC)
- specifické kvasinky a plísně
Inkubační doba před analýzou: není vyžadována
Kvantitativní výsledky k dispozici během 45 min
Řada aplikací:
- suroviny (koncentráty, kontejnerové ovoce)
- rozpracované produkty
- kontroly pasterizace
- technologická voda
- validace čistícího procesu
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Okamžitá analýza surovin


Okamžitá kontrola surovin před jejich vykládkou
Definovaná kriteria přijatelnosti převedení do výroby
např. přijmout, upravit, zamítnout

Bezprostřední hlášení problémů dodavatelům

Vrácení surovin nevyhovujících spefikacím před vykládkou
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Okamžitá analýza rozpracované výroby

Rychlá analýza objemných produktů před plněním



Větší využitelnost výrobních tanků a nádrží
 zvýšení flexibility výroby
 snížení investic do zařízení zvyšujících výrobní kapacitu
Optimalizace podmínek pro pasterizaci v závislosti na CFU/g


vyřazení nákladů na plnění ze specifikace produktu
minimalizace produktových ztrát & úspora energie
Rychlé odhalení, lokalizace & korekce kontaminace

minimalizace produktových ztrát & prostoje závodu
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Validace čištění

Zjištění kvality vody bezprostředně před použitím

Okamžitá kontrola účinnosti čištění

Optimalizace čistícího procesu v závislosti na obsahu mikrobů
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Testování technologické vody
• Celkový počet životaschopých mikroorganismů
•
Časová dostupnost:
do 30 min
Vyhodnocení stěrů a náběrů ze vzduchu
• Celkový počet životaschopých mikroorganismů
•
Časová dostupnost:
do 30 min
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Okamžité údaje k dispozici = skutečné úspory
•
•
Pozitivní výsledky k uvolnění surovin
–
Kontrola kvality před vykládkou
–
Minimalizace zpoždění hlášení problémů dodavatelům
–
Zabezepečení rychlé náhrady kontaminovaných materiálů
–
Významné úspory díky předcházení vzniku rizik
Aktivní monitoring kritických bodů ve výrobě
–
Rychlé odhalení a lokalizace kontaminace
–
Rychlé přijetí nápravného opatření
–
Významné energetické úspory díky optimalizaci procesu
pasterizace
–
Rostoucí výrobní kapacita a flexibilita
–
Nízké výrobní ztráty
–
Kvalitnější organoleptické znaky finálních
produktů
D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI
Zisky díky rychlosti a citlivosti
Suroviny
úspora 2 až 4 dny
Zpracování
úspora 2 až 4 dny
Konečný produkt
úspora 2 až 4 dny
CELKOVÁ ÚSPORA ČASU VE VÝROBNÍM CYKLU: 6 - 12 DNÍ
D-Count versus BactiFlowALS
Porovnání vlastností
Oba přístroje mají z
pohledu
mikrobiologa
shodné vlastnosti
(rychlost a citlivost detekce ….)
D-Count versus BactiFlow ALS
•
Při zpracování 75 vzorků za den
(ve dvou směnách) bude D-Count
spuštěn 2-3 x, BactiFlow ALS 3x-4x.
• BactiFlow ALS je vhodný pro vyšetření 100
– 125 vzorků za den
(8 hodin).
Aplikace pro stěrový monitoirng
Stěry z
prostředí
ANALYZÁTOR
Speciální pufr
Aplikace pro nálety z ovzduší
Náběr ze vzduchu
Miska s biopolymerem
Bioimpaktor
Sampl´Air
Aplikace pro nálety z ovzduší
Postup
Expose biopolymer
Peel from plate
Add to container
ANALYZÁTOR
Analyse on ChemScanRDI
Filter sample
Dissolve biopolymer
Validace metody
ChemScanRDI® byl validován FDA.
Validace BactiFlow® a D-Count® je provedena vždy pro
určitou skupinu výrobků a typ analyzovaných
mikroorganismů – je připraven standardní protokol s
přesným pracovním postupem.
Validaci pro jednotlivé výrobky i přípravu optimálních
laboratorních postupů lze provést za podpory
výzkumné laboratoře výrobce a distributora.
Typické aplikace:
potraviny, nápoje, farmacie, kosmetika
ChemScanRDI®
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Roztoky pro kontaktní čočky
Analgetika, Antibiotika
Sterilní lékové formy (injekční)
Nestrerilní lékové formy
Detergenty a čistící produkty
Heparin
Nosní kapky
Peritoneální dialyzační roztoky
Masti , krémy, šampóny
Cukerné roztoky
Vakciny, Vitaminy
Voda pitná a komerční vody přírodní či
minerální
Nápoje
……..
D-Count®, BactiFlow®
•
Fermentované mléčné výrobky
včetně probiotických
• UHT mléka, smetany, nápoje
• Tvarohy, dezerty
• Ovocné šťávy a nektary
• Ochucené nealko nápoje
• Ovocné koncentráty
• Kontejnerové ovoce
• Kontejnerová zelenina
• Voda pitná, přírodní, minerální
• Voda technologická
• Nesterilní farmaceutické formy
• Kosmetické a drogistické výrobky
……….
ChemScanRDI x D-Count - BactiFlow
Celkové shrnutí

Testování finálních výrobků v průběhu několika hodin, nikoliv dnů

Rychlé odhalení problémů (suroviny  konečný produkt)

Okamžité hlášení případů kontaminace

Rychlé přijetí účinných nápravných opatření

Minimalizace kontaminačních rizik a ztrát (jméno firmy)

Pokles nákladů na evidenci a skladování

Pokles výrobních ztrát

Pokles energetické spotřeby při pasterizaci nebo jiném ošetření

Minimalizace přerušení výroby

Růst flexibility výroby
Uživatelé •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ve farmacii a kosmetice
JOHNSON & JOHNSON (M)
MERCK (M)
ABBOTT
BAUSCH & LOMB
ALCON
GLAXO
HOECHST (M)
NOVARTIS (M)
AVENTIS PHARMA
ROUSSEL UCLAF
ROCHE (M)
SMITH & NEPHEW
SMITH KLINE BEECHAM
SANOFI (M)
DAIICHI
FUJISAWA
CHUGAI
(M) = multi instalace
- USA
- USA
- USA
- USA
- USA
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- EUROPE
- JAPAN
- JAPAN
- JAPAN
- JAPAN
Uživatelé •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ANTARTIC
CAMPINA
CARGIL
DANONE
DÉLIFRUITS
EHRMANN
COCA COLA
POLABSKÉ MLÉKÁRNY
EMMI
HUMANA MILCHUNION
IPARLAT
KERRY FOOD INGREDIENTS
LABOJUICE
MŮLLER
ONKEN
RIVELLA
RUDOLF WILD GMBH
KAUFLAND
ZOTT
v potravinářství
- FRANCE
- BENELUX, GERMANY
- BENELUX
- CZECH, USA, FRANCE,SPAIN, …
- FRANCE
- GERMANY
- GERMANY, USA, FRANCE
- CZECH
- SWITZERLAND
- GERMANY
- SPAIN
- UK
- BENELUX
- GERMANY, UK…
- GERMANY
- SWITZERLAND
- GERMANY
- GERMANY, CZECH
- GERMANY, POLEN…
Uživatelé •
•
•
ASAHI
AMSTEL
HEINEKEN
v pivovarnictví
- JAPAN
- NETHERLAND
- GERMANY