Transcript LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

LABORATORIO DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
Dra Susana Elgueta Miranda
RESPUESTA INMUNE

El sistema inmunológico está programado
para:



Diferenciar entre lo propio y lo extraño
Defensa contra agentes externos
Las Moléculas responsables de estos eventos,
pertenecen al MHC
LEUCOCITOS PASAJEROS
ALORECONOCIMIENTO
RESPUESTA MUY VIGOROSA. 1-10% DE
LT RESPONDEN A ALOANTIGENO
 CLONES RESTRINGIDOS POR MHC
PRESENTAN ALOREACTIVIDAD
 PORCION TCR INVOLUCRADO EN
RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC
RECONOCE ALOANTIGENO

RESPUESTA A ALOANTIGENOS


GRAN EXPRESION MOLECULAS CMH,
RECONOCIMIENTO DIRECTO POR
REACCION CRUZADA, ESTIMULA
CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD
RESPUESTA POLICLONAL Y
POLIESPECIFICA
FUNCIONES LABORATORIO ISP
Laboratorio Nacional y de Referencia:
*Estudio de histocompatibilidad a
Receptores (potenciales) y Donantes
*Asignación de riñón de donante cadáver

*Tipificación HLA en enfermedades: B27,
DR
 Lleva la Lista Nacional de Receptores de
Organos (en espera y trasplantados)
 Otros: PEEC B27, Capacitación etc
BARRERAS ANTIGENICAS EN
TRASPLANTE DE ORGANOS

Grupo sanguíneo ABO

Antígenos del CMH (HLA)

Antígenos de Complejos Menores de
Histocompatibilidad
Requerimientos variables según órgano o
tejido
OTROS ALOANTIGENOS

LEWIS

ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR


MICA / MICB
(MICC, MICD, MICE son pseudogenes )
VIMENTINA
REQUERIMIENTOS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
HIGADO
CORAZON
RIÑON
MEDULA OSEA
LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
ANTIGENOS
ANTICUERPOS
Estudios

RECEPTOR




DONANTE


Tipificación HLA
Existencia de anticuerpos anti-HLA (panel de
anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante
Detección de la aparición de anticuerpos anti-HLA
post-transplante
Tipificación de HLA
RECEPTOR/DONANTE

Prueba cruzada (crossmatch XM)
EFECTO HLA EN TRASPLANTE
RENAL





SOBREVIDA INJERTO
FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS
GRADO INMUNOSUPRESION
DISMINUYE RIESGO DE
SENSIBILIZACION
(IMPACTO ECONOMICO)
Donante vivo/ donante cadavérico
HERENCIA CMH
A2
B8
DR3
A1
B5
DR8
a
A9
B12
DR2
b
A3
B16
DR4
c
d
ac, ad , bc, bd
HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2
A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4
A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2
A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4
25% idénticos
25% 0 match
50% semiidenticos
Tipificación de HLA

Métodos serológicos:
CDC: citotoxicidad dependiente de
complemento


Métodos moleculares:


PCR-SSP (iniciadores secuenciaespecíficos)
PCR-SSO (sondas secuencia-específicas)
Métodos serológicos
• Identificacion Antigenos
Placas con antisueros especificos
(a-HLA A2, A3, B5, B7 etc)
Celulas con antigenos a identificar
• Pesquisa de Anticuerpos
Suero para determinar existencia
anticuerpos
Células con Antigenos conocidos
Tipificación:
Métodos serológicos
2 x 106/ml
lymphocytes
30 minutes
incubation
Dispense 1 l of T or
B lymphocytes
Rabbit
Complement
1 hour
incubation
Dispense 5 l of Class I or II
rabbit complement
Dispense 10 l of StainFix™
or
5 l of Fluoroquench™
Evaluation
and
Reporting
Tipificación:
Métodos serológicos
“1” Reaction
0–10% Dead Cells
“6” Reaction
51–80% Dead Cells
“2” Reaction
11–20% Dead Cells
“4” Reaction
21–50% Dead Cells
“8” Reaction
81–100% Dead Cells
TECNICAS MOLECULARES



BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA
SEROLOGIA
kits CTS
Biotest
One Lambda
RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR
GRUPOS DE ALELOS
ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS
Y SUS VARIANTES
Micro
TM
SSP
1. Agregar Amplitaq de
Perkin-Elmer y la muestra
de DNA en el tubo de DMix
Procedimiento
2. Agregar 10 ul de la
solucion que contiene el
DNA/mezcla-D a cada
uno de los pozos de la
micro-placa del SSP, con
excepción del pocillos
que es el control
negativo.
4. Transferir
el producto
de la
reacción de
PCR en un
gel.
3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)
Micro SSPTM Procedimiento
1
2
3
4
5. Correr la electroforesis.
6. Analizar los
patrones de bandeo
y asignar los alelos
correspondientes.
5
6
7
8
9
10
11
12
7. Interpretación
TIPIFICACION HLA-A,B,DR
Antígeno
Subtipos
Tipificación Serológíca
A28
B40
DR5
A68
B61
DR11
Tipificación Molecular
Baja resolución A*68
B*40
DRB1*11
Intermedia
A*6801/6804
DRB1*1101/1104/1106
B*4001/4006
Alta resolución A*6801 B*4006
DRB1*1104
MATCH O COMPATIBILIDAD
ANTIGENOS PRESENTES EN EL
RECEPTOR Y EN EL DONANTE
MISMATCH O
INCOMPATIBILIDAD
ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE
Y AUSENTES EN EL RECEPTOR
EJEMPLO

HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR
HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADRE

HLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5

HERMANO
EJEMPLO





R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6
MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5
HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8
HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8
HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6
COMPATIBILIDAD (MATCH) E
INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH)
RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ;
DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3
DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3
DONANTE 1
MATCH : 1A 1B 2DR
MM
: 1A 0B 0DR
DONANTE 2
MATCH : 1A 1B 1DR
MM
: 1A 0B 0DR
UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.
UN EJEMPLO (1)
CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION
LOCUS A* LOCUS B*
PACIENTE
23, 24
49, 62
HERM. A
23, 24
49, 62
HERM. B
23, 24
49, 62
MADRE
23, 32
49, 60
PADRE
24, 62,-
DRB1*
04, 04, 04, 04, 04, -
UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.
UN EJEMPLO (2)
CLASE II POR SSP ALTA
LOCUS A*
PACIENTE
23, 24
HERM. A
23, 24
HERM. B
23, 24
MADRE
23, 32
PADRE
24, -
RESOLUCION
LOCUS B* DRB1*
49, 62
0405, 0407
49, 62
0404, 0407
49, 62
0405, 0407
49, 60
0404, 0405
62,0404, 0407
Antigenos y alelos
Antigenos y alelos
HLA-DR
HLA-DR
COMPATIBILIDAD DONANTE
RECEPTOR


MEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE
RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA
EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL
MATCH HLA ES BENEFICIOSO
INMUNOGENICIDAD HLA
MM PERMITIDOS
 MM PROHIBIDOS
B7 en RECEPTOR A1
 FENOTIPO RECEPTOR
DR6: a-A10, A11, A19, B35
 OTROS : Cw, DQ, DP

SENSIBILIZACION
PRESENCIA DE
ANTICUERPOS ALOREACTIVOS
CONSECUENCIAS DE LA
SENSIBILIZACION

Menor posibilidad de trasplante (XM positivo)

Mayor tiempo en lista de espera

Sobrevida menor del injerto renal
HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)
ANTICUERPOS ANTI-HLA

RECHAZO HIPERAGUDO DEL
INJERTO

RECHAZO AGUDO HUMORAL

DAÑO CRONICO DEL INJERTO
CADA MOLECULA HLA
PUEDE TENER MUCHOS
DETERMINANTES
ANTIGENICOS DIFERENTES
ANTICUERPOS ANTI-HLA




ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS
T DEPENDIENTES
RESPUESTA PRIMARIA
IgM
RESPUESTA SECUNDARIA
IgG
PRODUCCION DE CELULAS DE
MEMORIA
VIAS DE
SENSIBILIZACION
EMBARAZOS
TRANSFUSIONES
TRASPLANTES
(ANTICUERPOS NATURALES)
Detección de anticuerpos
anti-HLA y especificidad
Metodología
 CDC
 ELISA
 Citometria de flujo
 Detección por luminex
(LABSCREEN®)
Detección de anticuerpos
anti-HLA por CDC


Panel de células (congeladas)
PRA ( panel reactive antibody)
Paneles diseñados para asegurar una
cobertura máxima de antígenos
Porcentaje de anticuerpos a-HLA
0%
100%
Detección de anticuerpos
anti-HLA por ELISA




Anfígenos son purificadas de líneas de
células transformado por EBV.
Detección de IgG o IgM – depende en el
anticuerpo secundario que usan.
Detecta sólo Ac a-HLA
Determinación de %PRA e identificación
de especificidad de los anticuerpos.
Detección de anticuerpos
anti-HLA por FlowPRA™




Antígenos purificados acoplados a
microperlas que pueden ser detectadas
en un citómetro de flujo.
Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA
Detecta sólo Ac a-HLA
Determinación de %PRA e identificación
de especificidad de los anticuerpos.
Sensibilidad en detección
de anticuerpos anti-HLA
Mayor sensibilidad
FlowPRA
ELISA
CDC
Menor sensibilidad
CROSSMATCH (PRUEBA DE
REACCION CRUZADA XM)
Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el
suero del receptor, contra los antígenos
del donante
DISTINTOS METODOS:
CDC: distintas células, tiempos de
incubación, lavados, etc.
CITOMETRIA FLUJO: mayor sensibilidad
IMPORTANCIA DE XM POSITIVO
DEFINIR ESPECIFICIDAD
DE LOS ANTICUERPOS
SENSIBILIZACION Y
TRASPLANTE RENAL

ANTICUERPOS anti-HLA

ANTICUERPOS anti-NO HLA
• ANTIGENOS MENORES DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
• AUTOANTICUERPOS
ANTIGUO ESCENARIO
XM (+)
XM (- )
CONTRAINDICACION Tx
BAJO RIESGO
CAMBIO DE CONCEPTO
ANTICUERPOS Y CROSSMATCH
ANTICUERPOS (–)
XM (–)
ANTICUERPOS (–)
XM (+)
ANTICUERPOS (+)
XM (+)
ANTICUERPOS (+)
XM (–)
DEFINIR RIESGO
TOMA DE DECISION
EXITO
FRACASO
Risk assessment for antibody-mediated rejection
Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies
Contra
indicated
High risk
Current positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Historical positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Current and historical negative
Cytotoxicity
Flow cytometry
Transplantation 2004, 78(2): 186
Intermediate
Low risk
TIPOS DE DONANTES
DONANTE VIVO
DONANTE CADAVERICO
ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTE
MINSAL
FONASA
HISTOCOMPATIBILIDAD. I.S.P.
Estudio DC
Selección R
LAB. VALDIVIA
Regional
CENTROS
CENTROS
TRASPLANTES PROCURA
CORPORACION TX
Pesquisa, procuramiento
Coordinación
HISTOCOMPATIBILIDAD Y
TRASPLANTES
LISTA ESPERA
ABO
HLA-A,B,DR
PRA
ESPECIFICIDAD
D.CADAVER
ABO
HLA-A,B,DR
XM LT-LB
RELACION INJERTO/RECEPTOR
HUESPED RECHAZA INJERTO
INJERTO RECHAZA HUESPED
TOLERANCIA
INMUNOSUPRESION
¡GRACIAS!