Transcript to get the file

Métodos alternativos a la Experimentación Animal
Tema 10. VALORACIÓN DE RESULTADOS.
Relación dosis-respuesta
Base para la evaluación del peligro y el riesgo
FORMAS DE DETERMINAR LA TOXICIDAD
- Efectos bioquímicos
- Modificaciones fisiológicas
- Alteraciones reproductivas
- Muerte: DL50
- NOEC
PRINCIPIOS ESTADÍSTICOS
- Diseño experimental
- Muestreo
- Modelización
- Recolección de datos
- Las pruebas y las metodologías
- Interpretación de los resultados
Análisis de relaciones
- Dos o más variables
- Análisis de regresión
- Selección de la ecuación matemática (el modelo)
- Depende del tipo de variables
Las variables
- CUALITATIVAS
Cuantitativamente
Regresión
Discretas (números enteros)
- CUANTITATIVAS
Regresión
Continuas (números reales)
MODELOS MATEMÁTICOS EN EL ANÁLISIS DE RELACIONES
MECANÍSTICO
Describir un proceso basándose en postulados acerca de la
mecánica de dicho proceso
EMPÍRICO O DESCRIPTIVO
Describir cuantitativamente los patrones de las observaciones sin
basarse en los procesos subyacentes o mecánica del proceso
DETERMINÍSTICO O NO ESTOCÁSTICO
Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo
es siempre el mismo valor
PROBABILÍSTICO O ESTOCÁSTICO
Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo
es un valor variable
MÉTODOS ESTADÍSTICOS
 Necesarios para la validez y precisión de las pruebas
 Sobre diseño, planificación, ejecución y análisis de resultados
 Seleccionar un método estadístico sencillo ajustado a las
condiciones experimentales que permita obtener resultados
válidos
DISEÑOS DE EXPERIMENTOS DE TOXICIDAD
 Nº razonable de repeticiones
 Aleatorización de las dosis
 Existencia de un control necesario para estimar el error
experimental
DISEÑO Y EJECUCIÓN DE ENSAYOS DE TOXICIDAD
ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO
- UNIDAD EXPERIMENTAL
- RESPUESTA (punto final)
Observación, medición, identificación
- CONDICIONES PARA LA EVALUACIÓN
Tamaño de la población, ensayo de supervivencia en paralelo
- GRUPOS DE TRATAMIENTO
Dosis-respuesta, controles, varias muestras individuales
- FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos)
- FUENTES DE SESGOS
- MÉTODOS DE EVALUACIÓN ESTADÍSTICA
ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO
- FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos)
DENTRO DE LOS ENSAYOS
Errores en diluciones
Imprecisiones en el pesado
Errores al medir volúmenes
ENTRE ENSAYOS
¿reproducibilidad?
Las propiedades físicas y químicas de
los agentes
Almacenamiento y preparación
Errores en el conteo
Cambios en las condiciones de cultivo
de los organismos
Variación biológica (genética,
fisiológica)
Cambios históricos en el protocolo
Etc
Cambios en el personal del laboratorio
Cambios genéticos en el material
biológico
Reproducibilidad o replicabilidad
- Propiedades físicas y químicas de los compuestos conocidas y
controladas
- Preparación y almacenamiento de los compuestos, solventes y
diluciones controlados
- Manejo y uso de los organismos prueba (animales, células)
- Número de repeticiones del ensayo
- Número de tratamiento/grupos de dosis
- Intervalos de las dosis
- Selección de controles
- ALEATORIZACIÓN
DISEÑOS MÁS COMUNES EN LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD
1. Establecimiento de la relación dosis-respuesta
2. Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados o
expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0)
TIPOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESULTADOS
1. Paramétricos
2. No paramétricos
Suposiciones y/o estimaciones acerca de
los parámetros de las distribuciones
probabilísticas de la variable
1. Establecimiento de la relación dosis-respuesta
- De tipo mortalidad
¿………?
Obtener las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado
para relacionar las variables. Y utilizar el modelo con las estimaciones
de los parámetros encontrados para determinar los valores de la
variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto
sobre los organismos expuestos.
Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico)
concentración
Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico)
Método de Spearman-Kärber (no paramétrico)
Método gráfico
- De tipo inhibición del crecimiento (variable cuantitativa continua)
- De tipo mortalidad (Estimación de CL50, CE50 , CI50)
Probit
Litchfield-Wilcoxon
Dos o más mortalidades
¿Adecuación del modelo?
Spearman-Kärber
Método gráfico
No
Sí
¿Significación estadística?
Sí
Método Probit
No
¿Una o más
mortalidades
parciales?
No
Método
gráfico CL50
Sí
¿Mortalidad nula en
la CE más baja y
letalidad total en la
más alta?
No
Sí
Método de
SpermanKarber
CL50 e intervalo de
confianza al 95%
Método de
SpermanKarber ajustado
- De tipo mortalidad
Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico)
• Concentración de la sustancia o dosis (d).
• Número de individuos (n).
• Número de organismos muertos o afectados (r).
• Porcentaje de efecto (p).
p = (r/n) x100
Transformación a escala logarítmica
X = log10(d)
tablas de Probit
p (porcentaje de efecto)
unidades probit
- De tipo mortalidad
Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico)
Construcción de un gráfica a partir de los datos de las pruebas de
toxicidad aguda
DETERMINACIÓN DE
CL50, CE50, CI50
Mediante el uso de la recta trazada se obtiene
en el eje logarítmico la concentración
correspondiente al 50% del efecto observado
sobre el eje probabilístico
Log X
- De tipo mortalidad
Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico)
CÁLCULO DEL
INTERVALO DE
CONFIANZA
- Obtener las concentraciones de 16, 50 y 84%
- Calcular la pendiente de la recta (S):
CL84 /CL50 + CL50 /CL16
S=
2
- Calcular el número de individuos (N) en los que
se observó porcentaje de efecto entre 16 y 84%
- Calcular el exponente E y con él calcular el
factor fCL50.
2,77
E=
N’
f CL50 = SE
- CALCULAR EL INTERVALO DE CONFIANZA
(CL50) (fCL50) = límite superior al 95% de confianza
(CL50/Fcl50) = límite inferior
- De tipo mortalidad
Método de Spearman-Kärber (no paramétrico)
Proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar
CL50 = m =Xk – d (S1 – ½)
Xk = dosis mínima a partir de la cual todas las reacciones son del 100%.
d = distancia entre cada dos dosis.
S1 = suma de las fracciones de individuos que presentaron reacción.
Sn = 2S2 – S1 – S12 – 1/12
S2 = suma de la fracción acumulada de los individuos que presentaron reacción.
- De tipo inhibición de crecimiento
VARIABLE CUANTITATIVA CONTINUA
- Estimación de la relación D-R con métodos de regresión
- Transformación de la concentración a logaritmos para obtener
una distribución normal
- Transformación de variable respuesta en función de la
distribución
2- Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados
expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0)
- Para la determinación del NOEC y del LOEC
- Implica pruebas de hipótesis
- ANOVA seguido de la prueba a posteriori de Dunnet.
REQUISITOS:
- Supuestos de ANOVA:
Varianzas homogéneas (Ej. Prueba de Barlett o de Levenne)
Independencia de errores
Distribución normal de los residuos (Prueba de Shapiro-Wilk)
- Nº de replicados por tratamiento sea > 3 (OBLIGATORIO)
- Todos los tratamientos tengan el mismo número de replicados
Prueba de t con ajuste
de Bonferroni
Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados expuestos
a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0)
Si no se verifican los supuestos de ANOVA:
A) Transformar la variable dependiente (respuesta) hasta
obtener una que verifique dichos supuestos
B) Aplicar métodos no paramétricos
Kruskal-Wallis
Mann-Whitney
Wilcoxon con ajuste de Bonferroni
Referencias

Díaz Baez, M.C., Bulus Rossini, G.D., Pica Granados, Y. 2004. Métodos Estadísticos para el
Análisis de Resultados de Toxicidad. En ENSAYOS TOXICOLÓGICOS Y MÉTODOS DE
EVALUACIÓN DE CALIDAD DE AGUAS: Estandarización, intercalibración, resultados y
aplicaciones. http://web.idrc.ca