Transcript Document

15. VAJA:
ENCIMSKA KATALIZA
ENCIMSKO KATALIZIRANE
REAKCIJE
Encimi so biološki
katalizatorji, ki
povečajo hitrost reakcij z znižanjem
aktivacijske
energije.
Ravnotežne
koncentracije reaktantov in produktov pri
tem ostanejo nespremenjene.
Encimi znižajo aktivacijsko energijo:
Encimi se od anorganskih katalizatorjev
razlikujejo po tem, da:
so
encimi
praviloma
boljši
katalizatorji,
delujejo pri milih reakcijskih pogojih,
specifično prepoznajo substrate in
tvorijo specifične produkte,
so pod vplivom različnih mehanizmov
regulacije.
Encimi
katalizirajo
biokemične
reakcije – pretvorbe substrata (S) v
produkte (P).
Encimsko katalizirano reakcijo lahko
zapišemo kot:
E + S
k1
k2
ES
k3
P + E
V določen encim se lahko veže ena ali
nekaj različnih molekul substratov, da
nastane funkcionalni kompleks ES.
Encimi so lahko enostavne
sestavljene beljakovine.
ali
Nekateri encimi za svoje delovanje
potrebujejo koencime (kofaktorje), ki
so kovalentno ali nekovalentno vezani
nanje.
Encime glede na naravo kemijske
reakcije, ki jo katalizirajo, poimenujemo
in razvrščamo v 6 glavnih razredov:
 oksidoreduktaze,
 transferaze,
 hidrolaze,
 liaze,
 izomeraze,
 ligaze.
ENCIMSKA AKTIVNOST
Enote, s katerimi izražamo encimsko
aktivnost, so definirane kot število molov
substrata, ki se preoblikuje v časovni
enoti, pri določenih reakcijskih pogojih
(T, P, pH).
V uporabi so 3 enote:
oIU,
okatal,
ospecifična aktivnost.
Ena IU encima ustreza
katalizira
pretvorbo
substrata v produkt na
določenih pogojih pH,
koncentracije substrata.
količini, ki
1
μmola
minuto, pri
T, IJ in
Katal encimske aktivnosti predstavlja
spremembo 1 mola substrata v
produkt, v 1 sekundi. Ena IU ustreza
1/60 μkatala oz. 0,0167 μkatala. En
katal je tako enak 6 × 107
mednarodnih enot. Lahko se uporablja
tudi manjše enote, kot so milikatal
(mkatal),
mikrokatal
(μkatal),
nanokatal (nkatal).
Zelo uporabna kvantitativna definicija
encimske aktivnosti je specifična
aktivnost. Pomeni število encimskih
enot ali katalov na miligram proteina.
Specifična
aktivnost
je
merilo
čistosti encima. Med čiščenjem
encimov specifična aktivnost narašča.
Aktivnost encimov je odvisna od:





koncentracije substrata,
kofaktorjev,
pH,
temperature,
ionske moči.
DOLOČANJE HITROSTI
ENCIMSKE REAKCIJE
Eksperimentalno jo lahko določamo
tako, da merimo:
 porabljanje substrata
ALI
 nastajanje produktov
v odvisnosti od časa.
v  k A B
a
b
Za splošno reakcijo: aA + bB → P
lahko matematično zapišemo:
v  k A B 
a
b
pri čemer je k
hitrostna konstanta.
proporcionalna
v  k A B
a
b
Michaelis in Mentenova ter Briggs in
Haldane so predpostavili splošno
enačbo za encimsko reakcijo:
E + S
k1
k-1
ES
k2
P + E,
pri čemer so k1, k-1 in k2 hitrostne
konstante reakcije.
Spreminjanje koncentracij intermediatov
Michaelis-Mentenove reakcije v odvisnosti
od časa:
Michaelis –Mentenov model encimske
kinetike sorazmerno dobro opiše večino
eno- in dvo-substratnih reakcij, ki jih
katalizirajo encimi z enim aktivnim
centrom (brez podenot).
Kooperativne kinetične modele pa
uporabljamo, kadar imajo encimi
kvartarno zgradbo in več aktivnih
centrov (imajo podenote).
Pri Michaelis – Mentenovem modelu
morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji:
 koncentracija S mora biti veliko večja
od koncentracije E,
 prva
reakcija (nastanek ES) je
reverzibilna,
 razpad ES v E in P je ireverzibilen.
Pri teh pogojih merimo
hitrost reakcije vo.
začetno
Odvisnost hitrosti encimsko katalizirane
reakcije od koncentracije substrata
opisuje Michaelis – Mentenova enačba:
vo  Vmax
S 
K M  S 
pri čemer je vo začetna hitrost reakcije,
vmax je maksimalna hitrost reakcije, KM pa
je Michaelis – Mentenova konstanta. Le-ta
predstavlja tisto [S] pri kateri je hitrost
reakcije enaka polovični vrednosti vmax.
Grafični prikaz Michaelis – Mentenove
enačbe:
KM in vmax sta značilni
za vsak par Encim –
Substrat pri določeni
T, pH in ionski sestavi
raztopine.
Hiperbolična
krivulja
ni
najprimernejša
za
natančno
odčitavanje
vmax
in
KM,
zato
uporabljamo Lineweaver – Burkovo
enačbo:
1  KM
 
vo  Vmax
 1
1


 S  Vmax
Za določitev KM in vmax uporabimo dvojni
recipročni oz. Lineweaver – Burkov
graf:
Naklon premice je enak K M ,
vmax
odsek na ordinati je
odsek na abscisi pa 
1
,
vmax
1
KM
.
Določanje encimske aktivnosti:
na hitrost reakcije vpliva izbira para
E - S,
meriti moramo v območju platoja
Michaelis – Mentenove krivulje,
meriti moramo pri optimalnem pH
encima,
meriti moramo pri optimalni T encima,
produkti reakcije morajo biti izmerljivi.
Dejavniki, ki vplivajo na hitrost
encimsko kataliziranih reakcij:
 koncentracija encima,
 koncentracija substrata,
 efektorji (moderatorji) encimskega
delovanja,
 temperatura,
 pH.
Vpliv temperature na hitrost encimsko
katalizirane reakcije:
Temperaturna stabilnost:
pH
medija
vpliva
na
encimsko
katalizirane reakcije na več načinov:
prizadene stabilnost oz. obstojnost
aktivne oblike encima;
spremeni afiniteto encima za vezavo
in pretvorbo substrata;
vpliva na hitrost reakcije (vmax).
pH optimum:
ENCIMSKA KATALIZA
DOLOČANJE ODVISNOSTI HITROSTI ENCIMSKE
REAKCIJE OD KONCENTRACIJE SUBSTRATA
Potek dela:
•
0,5 mL encimske raztopine tripsina dodamo 1,5 mL
delovne raztopine substrata (slepa proba: namesto
raztopine encima dodamo 0,5 mL pufra)
•
Inkubiramo 30 min na 37 °C.
•
Reakcijo prekinemo z dodatkom 1 mL 0,2 M HCl.
•
Izmerimo absorpcijo pri 410 nm.
Rezultat:
•
Nariši graf hitrosti encimske reakcije od
koncentracije substrata!
•
Iz Lineweaver-Burkovega diagrama določi KM za ta
par encima in substrata.
Vzorec
Encim
Pufer
(mL)
Substrat
(mL)
Čas inkub.
(min)
HCl
(mL)
S0–S2
0
0,5
1,5
30
1
S1
0,5
0
1,5
30
1
S2
0,5
0
1,5
30
1
S3
0,5
0
1,5
30
1
S4
0,5
0
1,5
30
1
S5
0,5
0
1,5
30
1
MERJENJE ČASOVNE ODVISNOSTI RAZGRADNJE
SUBSTRATA PRI ENCIMSKI REAKCIJI
Potek dela:
1. 0,5 mL encimske raztopine tripsina dodamo 1,5 mL
substrata S2 (slepa proba: namesto raztopine
encima dodamo 0,5 mL pufra)
2. Inkubiramo 5, 10, 15 oz. 30 min pri 37 °C; slepo
probo inkubiramo 30 min.
3. Reakcijo prekinemo z dodatkom 1 mL 0,2 M HCl.
4. Izmerimo absorpcijo pri 410 nm.
Rezultat:
1. Nariši graf odvisnosti A410 od časa inkubacije!
Vzorec
Encim
(mL)
Pufer
(mL)
Substrat
(mL)
Čas inkub.
(min)
HCl
(mL)
S2-0
0
0,5
1,5
30
1
S2-1
0,5
0
1,5
5
1
S2-2
0,5
0
1,5
10
1
S2-3
0,5
0
1,5
15
1
S2-4
0,5
0
1,5
30
1
pH OPTIMUM TRIPSINA
Encim: tripsin
Substrat: 0,001 M BAPNA
pri pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
Postopek:
1. 0,5 mL raztopine tripsina (slepa proba pufer)
dodaj 1,5 mL substrata v določenem pH (slepa
proba: substrat pH = 9).
2. Inkubiraj 30 min pri 37 oC
3. Dodaj 1 mL 0,2 M HCl.
4. Izmeri absorbanco pri 410 nm.
Rezultat:
1.
Nariši graf odvisnosti A410 od pH substrata in
odčitaj pH optimum tripsina!
T odvisnost TRIPSINA
Encim: tripsin
Substrat: 0,001 M BAPNA
v Tris pufru (pH 8,2)
Postopek:
1. 0,5 mL raztopine tripsina (slepa proba pufer)
dodaj 1,5 mL substrata.
2. Inkubiraj 5 min pri 4°C, 20°C, 37°C, 80°C.
3. Dodaj 1 mL 0,2 M HCl.
4. Izmeri absorbanco pri 410 nm.
5. Drugo serijo epruvet inkubiraj 30 minut pri
enakih T, dodaj 1 ml 0,2 M HCl in izmeri A410.
Rezultat:
1.
Nariši graf odvisnosti A410 od T pri različnih
časih (v enem grafu pri 5 in 30 min)!
DOLOČANJE ODVISNOSTI HITROSTI ENCIMSKE
REAKCIJE OD KONCENTRACIJE SUBSTRATA
Vzorec
S1
S2
S3
S4
S5
A410
MERJENJE ČASOVNE ODVISNOSTI RAZGRADNJE
SUBSTRATA PRI ENCIMSKI REAKCIJI
Vzorec
S2-S1
S2-S2
S2-S3
S2-S4
A410
pH OPTIMUM TRIPSINA
pH
3
4
5
6
7
8
9
10
A410
T ODVISNOST TRIPSINA
Čas inkub.
(min)
T (°C)
5
4
5
20
5
37
5
80
30
4
30
20
30
37
30
80
A410