Transcript Enzimologia
Enzimologia
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
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A vida e a energia para a vida
Duas condições fundamentais: 1.
Autorreplicação 2.
• Metabolismo Catálise enzimática A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos Um saco de açúcar pode permane cer anos na prateleira do supermercado – A prateleira não tem enzimas!
• Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos – Reações catalíticas promovem a oxidação da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
Participam das vias bioquímicas
• • Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica • Permitem resposta e adaptação a um meio em mudança
O que são as enzimas?
• • • • • Proteínas notáveis, altamente especializadas – Alto grau de especificidade com substratos Poder catalítico extraordinário – Muito maior do que catalisadores sintéticos Aceleram reações químicas – Em condições suaves de temperatura e pH São o centro e o objeto de estudo principal da bioquímica – Atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem • Como os cientistas descobriram as enzimas?
Um pouco de história...
L OUIS P ASTEUR
1835: Berzelius, conceito de catálise 1885: fermentação do acúcar por lêvedos, gerando álcool Louis Pasteur 1822-1895 Vitalismo: o mágico élan vital 1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num extrato de lêvedo sem vida!
Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
E MIL F ISCHER
Sacarase Quebra da sacarose em glicose e frutose Hermann Emil Fischer 1852 - 1919 Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase Modelo de ação enzimática
chave-e-fechadura
Enzimas são proteínas?
Qual a natureza das enzimas?
O químico orgânico alemão Richard Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pela estrutura da clorofila – James Batcheller Sumner 1887-1955 conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas!
Willstater criticou os resultados…
SIM!
Mas como funcionam?
Kunitz e Northrop Eletroforese e centrifugação: enzimas estão na fração protéica!
Mesmo em quantidades proteícas indetectáveis pelos métodos, as enzimas continuavam tendo atividades John Howard Northrop 1891-1987 Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
Finalmente, Sanger
1952 Publica a primeira estrutura primária de uma proteína: a Insulina, com 51 aminoácidos O trabalho mostrava também que a
estrutura das proteínas poderia ser
terminal Frederick Sanger 13 August 1918 descrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
C
ONCLUSÃO:
H
ISTÓRIA DA
B
IOQUÍMICA As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica) >gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Toda enzima é proteína?!
• • Não!, há alguns RNAs que funcionam enquanto enzimas também Componente químico adicional necessário para a função – Cofator: íons inorgânicos – Coenzima: moléculas orgânicas complexas – Se liga muito firmemente: grupo
prostético
• Enzima completa: holoenzima – Parte protéica: apoenzima ou apoproteína
Nomenclaturase das enzimases
• Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada – Urease – hidrolisa a uréia – DNA-polimerase – polimeriza DNA – Pepsina –
pepsis
vem do grego (digestão) • Sistema de classificação enzimático –
EC number
– Quatro números: 2.7.1.1
• 2: transferase • 7: fosfotransferase • 1: transfere P para grupo OH • 1: tem D-glicose com aceptor
Reação enzimática
• • • Reação se dá em fases: Enzima aumenta a velocidade das reações Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação
Equilíbrio químico
• • • As enzimas realizam, muitas vezes, as reações nos dois sentidos A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima substrato – Interações fracas entre ES são otimizadas no estado de transição
• Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao
Estado de
transição (ET), não ao substrato • ET não é forma estável • Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática • Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes
Bastonase
Estabiliza o substrato
Especificidade enzimática
• Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico • Redução da entropia pela ligação – Dessolvatação do substrato – Ajuste induzido, proteína tbm muda de conformação
Grupos catalíticos
• • • Catálise geral ácido-base – Transferência de prótons Catálise covalente – Formação de lig. covalente transitória entre E e S • Ativação do substrato Catálise por íons metálicos – Estabilizam estados de transição – 1/3 das enzimas conhecidas usam íons metálicos nas reações catalíticas • Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto - quimiotripsina
Cinética enzimática
• Experimentos de mutagênese sítio- dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica • • • A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato Constante de Michaelis – kM = [S] correspondente a ½ Vmax;
Reações com 2 ou mais substratos
• Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma depois-da-outra • Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH – Maior velocidade está normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua
Inibição reversível
• Inibição competitiva – Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo • A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta • Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima – Podem ser usados como drogas
Exemplos de reações enzimáticas
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Quimiotripsina Lisozima
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Hexocinase Enolase
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Beta-lactamases Proteases do HIV
A quimiotripsina
• Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr) • Forma intermediário acil-enzima covalente
A hexocinase
• • Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato Fosforila um resíduo de glicose • • Primeiro passo da via glicolítica Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que ela fosforile a água
A enolase
• Realiza desidratação reversível de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato – Dímero com 436aa • Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição – Interações estabilizam intermediário (enolato) – Ligações de H com outros aa’s do sítio ativo contribuem para o mecanismo geral
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A lisozima
Agente antibacteriano natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo – Peptideoglicano da parede de bactérias é seu substrato • Constituinte da parede microbiana que protege da
lise osmótica
– Enzima rompe ligação glicosídica • • Monômero com 129 aa’s Mecanismo específico de ação enzimática ainda é controverso “mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”.
Albert Einstein
Medicamentos
• Muitos são inibidores de enzimas são usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS • Penicilina (Alexander Fleming, 1928) – Peptideoglicano: polímero de açúcares e D-aa’s da parede bacteriana – Penicilina interfere na síntese do peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala – Inibem reação de transpeptidase
Os Beta-lactâmicos
• • • Penicilina: degradada no ambiente do estômago Penicilina V: estável em meio ácido pode ser administrada em via oral Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito • O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível – Transpeptidase inativa!
– Bloqueia síntese da parede bacteriana • Rompe-se devido à pressão osmótica
As Beta-lactamases
•
Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
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Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva
– O mau uso dos antibióticos
Guerra contra as bactérias
• • Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico • • Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
Os antivirais: (1) o que é um vírus?
• Anatomia molecular viral – Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de proteínas (capsídeo) – Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou dupla (fita positiva ou negativa) •
Genomas compactos
– Contêm apenas as proteínas necessárias à replicação viral – Genomas da ordem de Kb
Parasitismo intra-celular
• • •
O vírus não tem metabolismo próprio
– Não é um organismo de
vida-livre
–
Parasita intra-celular obrigatório
Forma de cristal Sequestra a maquinaria molecular da célula
– Mecanismo moleculares de produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)
Variedades virais
• • •
Vírus de DNA
– Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente transcritos em RNA
Vírus de RNA
– Podem atuar no citoplasma
Vírus de RNA com transcrição reversa
– Acontece a transcrição reversa do RNA em DNA e o DNA é normalmente
integrado
ao genoma do hospedeiro
HIV
• • SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana – – Pandemia Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos Retrovírus (lentivirus) – 2 cópias de um RNA fita simples (fita +) – – Nove genes Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24 • 0,6% da população humana está infectada
AZT (azidotimidina)
• • • Mimetiza um nucleotídeo de timina – Azida no lugar de hidroxila Prejudica a ação da transcriptase reversa Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que, aos poucos o vírus se torne resistente Transcriptase reversa
mutante
passa a não reconhecer mais o AZT
Outros tratamentos
• • • Inibidores de protease – Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros Inibidores de integrase – Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro Inibidores de fusão – Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam receptores celulares de ligação ao HIV • Coquetel anti-AIDS – dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
Proteases do HIV
• • O RNA do vírus é traduzido em grandes proteínas – Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em proteínas individuais do capsídeo A protease do HIV é uma aspartil-protease – 2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à ligação peptídica
Inibidores de proteases
• • Drogas que formam complexos não-covalentes com a protease do HIV – Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil – – Grupo hidroxil mimetiza a água Resto da estrutura encaixa nas fendas da enzima • Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição – – Sucesso terapêutico Aumentou longevidade e qualidade de vida dos doentes
Enzimas regulatórias
• Possui atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a certos sinais – Ajustes na velocidade da via metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação • Tipos mais comuns – Enzimas alostéricas (ligações reversíveis a compostos) – Modificações covalentes – Ativadas por remoção de segmentos peptídicos (irreversível) • Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
Enzimas alostéricas
• • Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato (hemoglobina) Heterotrópicas: outro ativador • • Enzimas alostéricas – Mais de um sítio regulatório • Cada um específico para um regulador Aspartato-transcarbamoilase – 12 cadeias polipeptídicas – Azul: catalíticas – Vermelho/Amarelo: regulatórias
Enzimas alostéricas são reguladoras
• • ... de vias bioquímicas Normalmente são o primeiro passo da via – “economiza” a execução das outras reações – Único passo de regulação da via • • Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo Inibição alostérica heterotrópica
• • •
Regulação por modificações covalentes
500 tipos diferentes Modificações pós- traducionais covalentes já foram descritos Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo – – Ubiquitinilação marca proteína para degradação Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima • Fosforilação é a mudança mais comum – Podem haver vários sítios fosforiláveis
Proteínas cinases e fosfatases
• Cinases: adicionam grupo fosforil a resíduos de
Ser
,
Thr
ou
Tyr
– Básicas: fosforilam resíduos de vizinhança básica – Preferências por resíduos próximos a
Pro
• Atómos de O – 2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína Reestabiliza a proteína estruturalmente • Atuam em cascatas de
sinalização celular
Cinases sítio-específicas
• Fosforilações são sítio específicas • Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de
S
,
T
ou
Y
• • Sítio de reconhecimento Sítio de fosforilação
Fosforilações múltiplas
• São possíveis e permitem controle requintado da regulação •
Glicogênio sintase
– Catalisa a união de glicoses para formar glicogênio – Fosforila em vários sítios (ver figura)
Proteólise de precursores
• • Proteases não podem ser produzidas em estado ativo – Do contrário destruiriam as proteínas celulares...
Zimogênios são precursores das proteínases – Só funcionam depois da ativação por proteínas – Ativação irreversível • Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró enzimas
Conclusões
• • • • • A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação
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Aula baseada no livro do Lehninger (Nelson e Cox)
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