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La spectrophotométrie
UV - visible
spectrophotométrie
• Les solutions ont la propriété d’absorber un domaine de
longueur d’onde du spectre visible et UV.
spectrophotométrie
• La lumière est un ensemble d’ondes
électromagnétiques.
• Le spectre électromagnétique est séparé en
plusieurs domaines, on cite :
• Le domaine visible compris entre 400 et
800 nm.
• Le domaine UV proche et lointain allant de
10 à 400 nm .
spectrophotométrie
• L’absorption de la lumière UV ou visible par
des molécules conduit à l’excitation des
électrons.
• L’énergie absorbée conduit au passage des
électrons d’un niveau basal E1 à un niveau
plus élevé E2.
• Il est possible de mesurer l’absorbance et
d’enregistrer ses variations en fonction de la
longueur d’onde. C’est la spectrophotométrie
en UV – visible.
spectrophotométrie
• La spectrophotométrie est une méthode
analytique quantitative qui consiste à mesurer
l'absorbance ou la densité optique
d'une substance chimique donnée,
généralement en solution .
• Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe
la lumière dans les limites de proportionnalité
énoncées par la loi de Beer-Lambert.
spectrophotométrie
• La densité optique des échantillons est
déterminée par un spectrophotomètre
préalablement étalonné sur la longueur
d'onde d'absorption de la substance à
étudier.
spectrophotométrie
• Un soluté coloré ou chromophore absorbe la lumière
visible (longueurs d'onde comprises entre 400
et 800 nm). On parle de spectrophotocolorimétrie ou
plus simplement de colorimétrie. Certaines solutions
absorbent dans l'ultraviolet (longueurs d'onde
inférieures à 380 nm), on parle alors de
spectrophotométrie UV.
• Les infrarouges ne sont pas utilisés en
spectrophotométrie car ils dépendent surtout de
la température de la solution et non de
sa concentration.
spectrophotométrie
• Soit un faisceaux lumineux incident d’intensité
Io , traversant une solution de concentration C
contenue dans une cuve d’épaisseur L.
• Une partie de la lumière sera absorbée par
l’échantillon alors que le reste va être transmis
sous forme d’un faisceau d’intensité I.
>>> Loi de Beer-Lambert
spectrophotométrie
• La relation de Beer-Lambert décrit que, à une
longueur d’onde λ donnée, l’absorbance d’une
solution est proportionnelle à sa concentration, et à
la longueur du trajet optique (distance sur laquelle la
lumière traverse la solution).
• Alors, pour une solution contenant une seule
substance absorbante :
•
est l’absorbance ou la densité optique (sans unité) de
la solution pour une longueur d'onde λ ;
•
(en mol.l) est la concentration de la substance
absorbante ;
•
•
(en cm) est la longueur du trajet optique ;
(en l.mol-1.cm-1) est le coefficient d’extinction
molaire de la substance absorbante en solution. Il rend
compte de la capacité de cette substance à absorber la
lumière, à la longueur d’onde λ.
Absorbance
• L’absorbance dépend de :
- la nature de la solution,
- de la concentration de l’entité chimique
responsable de la couleur,
- de l’épaisseur de solution traversée et
- de la longueur d’onde du rayonnement
incident
Le spectrophotomètre
• Il est équipé d’un dispositif analysant le
rayonnement entrant et sortant de la cellule.
Le spectrophotomètre
• Un spectrophotomètre mesure l’absorbance d’une
solution à une longueur d’onde donnée. Un
dispositif monochromateur permet de générer, à partir
d’une source de lumière visible ou ultraviolette, une
lumière monochromatique, dont la longueur d’onde est
choisie par l’utilisateur.
• La lumière monochromatique incidente
d’intensité Io traverse alors une cuve contenant la
solution étudiée, et l’appareil mesure l’intensité de la
lumière transmise. La valeur affichée par le
spectrophotomètre est l’absorbance à la longueur d’onde
étudiée.
Le spectrophotomètre
1. source de lumière polychromatique (lampe):
. elle émet un faisceau de lumière en direction
du monochromateur.
- Sources lumineuses :
• lampe à décharge au deutérium : domaine 190 à 400 nm
• lampe à filament de tungstène : domaine 350 à 800 nm
• lampe à décharge au xénon (très énergétique ) utilisée
dans le domaine UV et visible. Elle fonctionne sous
forme de flash, au moment de la mesure
Le spectrophotomètre
2. Monochromateur :
. un système qui sépare les différentes longueurs
d'onde d'un faisceau lumineux.
. Il y a 2 types de monochromateur :
• dispersion de la lumière par un prisme
• diffraction de la lumière par un réseau ou par un
cristal
Le spectrophotomètre
3. Cuves :
•
choisir le type de cuve adapté à la longueur d'onde :
–
–
quartz pour les ultra-violets (190 - 400 nm)
verre ou polystyrène pour le visible (400 nm - 800 nm)
•
ne jamais mettre les doigts sur les faces dépolies des cuves.
•
bien orienter la cuve par rapport à l'axe du faisceau lumineux.
•
supprimer toutes les bulles d'air.
•
Nettoyer la cuve de l’appareil avant et après chaque utilisation à l'eau ou
au détergent.
•
Attention à ne pas rayer les parois de la cuve lors de l'entretien.
Cuves
Le spectrophotomètre
4. Un photocapteur :
• c’est un élément photosensible (en général une
diode) qui transforme le signal lumineux en signal
électrique.
• En effet, le flux lumineux transmis par la solution
(d’intensité inférieure au faisceau incident car les
molécules de la solution en ont absorbé une partie)
est dirigé vers ce photocapteur qui fournit au
détecteur électronique un courant électrique
proportionnel à la quantité de photons du flux
lumineux.
Le spectrophotomètre
5. Un calculateur:
• il traite le signal électrique pour calculer
l’absorbance qui est proportionnelle à
l’intensité du courant et donc liée (par la loi
de Beer-Lambert) à la concentration de la
solution.
Applications Médicales
• Mesure la lumière absorbée par une solution
(échantillon) à une longueur d’onde donnée,
ce qui permet d’en déduire la concentration.
• Il permet donc de réaliser des dosages dans
différents milieux biologiques (sang, urine…).
• Suivre la cinétique de formation d'un produit
au cours d'une réaction enzymatique.
Avantages
• Molécules biologiques en solution.
• Méthode facile à mettre en œuvre.
• Simplicité des mesures.
• Permet de déterminer la concentration de molécules.
• Permet de tester l'effet de divers paramètres (pH, température, ...)
• Appareillage parmi les moins "onéreux" pour ce genre de gros
matériel de laboratoire.
dosage par étalonnage d’une espèce
colorée en solution aqueuse:
 Par exemple pour doser la glycémie d’un
patient;
 L’étalon c’est une solution de glucose de
concentration connue, à partir de cette
solution mère on prépare des solutions
filles.
 On mesure l’absorbance de la solution mère
ainsi que les solutions filles.
• On trace par la suite la courbe mettant en
œuvre la variation de l’absorbance en fonction
de la concentration.
*interprétation de la courbe:
• On observe que c’est une droite qui passe par
l’origine A=f(C) donc l’absorbance varie de
façon proportionnelle à la concentration.
• On mesure l’absorbance de notre échantillon
de concentration inconnue, on copie cette A
sur la courbe et on déduit la concentration ou
la glycémie de notre patient.
Spectre du permanganate de potassium
• la solution est violette
•La solution absorbe tout sauf le bleu
et le rouge : la solution absorbe le vert
Spectre du permanganate de potassium
•
Spectre du carotène