Transcript Ejercicio_1C-CV&Investigación

Período 2001-2007
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Proyecto 2
Caracterización funcional del dominio de unión a calmodulina de Trk: estudio de su papel
en la regulación de las vias de señalización. Ministerio de Sanidad y Consumo, PI042537,
2004-2007 IP: Marta Llovera Tomas
Período 2001-2007
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Búsqueda del dominio de interacción de TrkA con CaM
YRKF701-704
Posible motivo de tráfico Yxx (Jullien et al 2002)
Posible diana de fosforilación
Mutantes del YRKF701-704
Y701F: altera Yxx, no fosforilable
Y701D: altera Yxx, mimetiza
fosforilación
Período 2001-2007
Función de Y701 en la internalización de TrkA
Marsh & McMahon, 1999
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Rol de Y701 en la interacción del receptor con clatrina
La Y701 participa en la internalización de Trk
mediada por clatrina
Período 2001-2007
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Relevancia de Y701 en la actividad biológica de TrkA
La Y701 es importante para la diferenciación mediada por TrkA
Período 2001-2007
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Caracterización de la actividad de los mutantes de la Y701
Efecto de la mutación en la activación de vías
Actividad in vitro del receptor
Y701 es importante para la actividad del receptor Trk inducida por NGF
Período 2001-2007
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Publicaciones proyecto 2
de Pablo Y, Pérez-García MJ , Georgieva MV, Sanchis D, Lindqvist N, Soler RM, Comella
JX, Llovera M. Tyr-701 is a new relevant site for neurotrophin receptor TrkA
internalization and function. J Neurochem. En prensa (JNC-E-2007-0443.R2)
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Período 2001-2007
Colaboradores
Yolanda de Pablo
Maya Georgieva
Maria José Pérez-García
Christian Nake
Joaquin Egea
Mario Encinas
Judit Herreros
Rosa M Soler Tatché
Daniel Sanchis
Joan X Comella
Soporte técnico
Isabel Sanchez
Roser Pané
Rosa Gomez
Grupo de Señalización Celular y Apoptosis
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
D. Martín-Zanca (CSIC-USAL)
Natividad Rocamora (ICO)
Eduardo Soriano (PCB)
Uwe Drescher (King’s College,UK)
Elia Benito, UB
Jordi García, UB
Etapas
Período
Aportaciones
Predoctoral
1990-96
Implicación del TNF y el sistema proteolítico dependiente de ATP/Ub
en la degradación proteica muscular asociada a la caquexia cancerosa.
Postdoctoral-1 1997-98
En macrófagos activados, la nitración de proteínas en residuos Tyr
interfiere con las vías de señalización del IFN, debido al bloqueo de los
sitios de fosforilación.
Postdoctoral-2 1999-2000
El mutante de la prolactina G129R actúa como un antagonista en líneas
celulares de cáncer de mama.
Estrategias encaminadas a incrementar su afinidad por el receptor lo
convertirán en un potencial tratamiento contra el cáncer de mama.
Postdoctoral-3 2001-------
Calmodulina se une al extremo C-terminal del receptor de neurotrofinas
TrkA de forma directa y dependiente de calcio.
El motivo YRKF701-704 de TrkA participa en la endocitosis dependiente de
clatrina y la Y701 es importante para la actividad del receptor Trk.
Resumen índices bibliométricos
Total de artículos publicados
37
Artículos en posición relevante
27
Índice de impacto Promedio
Índice de citas acumulado
Índice de citas promedio
Artículo como primer autor más citado
Factor H
4,2
1172
31,7
104
20
Proyecto de investigación
Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la
interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA
2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA
Proyecto de investigación
Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la
interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA
2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA
 Unión de CaM en la región 668-790 de TrkA (Llovera et al 2004)
 Delimitar de manera más precisa la región de unión a CaM
GST-TrkAi427-790
GST-TrkAi714-790



Identificación de una región candidata para la unión de calmodulina
?
CaM
Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la interacción con CaM y de su
relevancia en la señalización por TrkA
Hipótesis de trabajo
Los aminoácidos hidrofóbicos del extremo COOH-terminal de Trk conforman un
motivo 1-14 de unión a CaM que es relevante para la señalización por TrkA:
secuencia VHARLQALAQAPPV771-784
Objetivos
1. Determinar si el dominio VHARLQALAQAPPV771-784 constituye el sitio de
interacción con CaM
2. Caracterizar la importancia de estos residuos en la señalización iniciada por
TrkA
3. Analizar si la mutación en este motivo afecta la interacción con las proteínas de
unión al extremo COOH-terminal de TrkA: PLC, la ligasa de ubiquitina Nedd4-2
y Csk homologous kinase
Metodología
Generación de mutantes de los residuos L778 y V784
TrkAwt
VHARLQALAQAPPV771-784
L778A
VHARLQAAAQAPPV771-784
L778A/V784A
VHARLQAAAQAPPA771-784
GSTY785

Ensayos bioquímicos:
 Test de la interacción de TrkA (C-teminal) con CaM
 Ensayos en células PC12nnr5:
 Analizar la activación de TrkA (autofosforilación, activación de cascadas de
señalización, diferenciación, supervivencia)
 Verificar la interacción y activación de proteínas que se unen al COOH-terminal
(PLC-, CHK, Nedd4-2)
Proyecto de investigación
Caracterización de dos regiones del dominio intracelular de TrkA
1. Estudio de la implicación del extremo C-terminal de TrkA en la
interacción con CaM y de su relevancia en la señalización por TrkA
2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA
Prof Ole N Jensen
Elisabetta Boeri-Erba
Anne J. Kleinnijenhuis

Protein Research Group
Dep. of Biochemistry and Molecular Biology
University of Southern Denmark
Odense M, Denmark.
m= 80 Da
D I Y S T D Y Y R
PO4
Intensity
y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
m/z
Inactive
Active
Lys538
Ser671
Ser671
Tyr674
Tyr675
catalytic site
Tyr674
Tyr675
2. Caracterización de la fosforilación de la Ser671 de TrkA
Hipótesis de trabajo
La fosforilación de TrkA en Ser671 juega un papel importante en la regulación de la
activación del receptor
Objetivos
1. Generar anticuerpos fosfoespecíficos contra TrkA fosforilado en Ser671 y sobre
la forma triplemente fosforilada en el loop de activación: S671/Y674/Y675.
2. Analizar la relevancia de la Ser671 en la activación de TrkA
3. Estudiar si esta Ser es también sitio de fosforilación en TrkB y TrkC
4. Averiguar qué Ser/Thr kinasa o kinasas son las responsables de esta
fosforilación.
5. Caracterizar la cinética de esta fosforilación en células PC12 y en cultivos
primarios de neuronas
Metodología
 Obtención de anticuerpos fosfoespecíficos: Dr Thorsten Wiederhold de
Cell Signaling Technology
 Caracterización de la cinética de fosforilación en Ser671
 Análisis de las vías de señalización implicadas mediante el uso
de inhibidores específicos (ej. PD98059 o U0126 para MEK1/2,
wortmanin o LY294002 para PI 3-kinasa…)
 Detección de fosforilación en el residuo equivalente en TrkB y
TrkC en sobreexpresión y en cultivos primarios de neuronas
corticales
 Generación de los mutantes puntuales de Ser671 :
S671A: mutante no fosforilable en Ser671
S671D: mutante que mimetiza la fosforilación en S671
 Estudiar la actividad de estos mutantes en células PC12nnr5
transfectadas con los plásmidos de expresión
• autofosforilación inducida por NGF
• activación de vías de señalización
• capacidad de transmitir el señal de diferenciación y
supervivencia
 Identificación de la kinasa implicada
¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671?
Position
Peptide
Kinase
GPS
Score
Cutoff
Score
671
DIYSTDY
IPL1(yeast)
7,500
5,0
671
DIYSTDY
PKB
8,000
3,2
671
DIYSTDY
S6K
6,000
5,8
1. Yu Xue, Fengfeng Zhou, Minjie Zhu, Guoliang Chen, and Xuebiao
Yao, 2005. GPS: a comprehensive www server for phosphorylation
sites prediction. Nucleic Acids Res. 33: W184-7
2. Fengfeng Zhou, Yu Xue, Guoliang Chen, and Xuebiao Yao, 2004.
GPS: a novel group-based phosphorylation predicting and scoring
method. Biochem Biophys Res Commun. 325(4):1443-8.
Web site: http://bioinformatics.lcd-ustc.org/gps_web/
Baker & McKinnon, 2004
¿Qué kinasa fosforila TrkA en Ser671?
 Ensayos kinasa in vitro con kinasas activas comerciales (PKB, S6K…)
Péptidos:
HHHHHHGGGRDIYSTDYYRVGGRRR
HHHHHHGGGRDIYATDYYRVGGRRR
GST-TrkAiwt y GST-TrkAi-S671A
 In-gel kinase assay
 Arrays de kinasas comerciales
 Una vez identificada la kinasa:
Interacción kinasa-sustrato (co-IP o cross-linking)
¿Fosforilación basal o regulación por “feed-back”?
TrkA
NGF
PDK1
Grb-2
Ras
Shc
FRS-2
SOS
Y490 P
P Y490
Grb-2 Shc
Raf-1
Gab1
PI3K
C3G
Rap-1
P Y785
Y785 P
S6K
B-Raf
MEK1/2
PLC
endosome
Akt
Ca2+
mTOR
Survival
ER
IP3
ERK1/2
DAG
PKCd
Differentiation
Colaboradores
Mass spectrometry analysis
Prof Ole N Jensen
Dr Elisabetta Boeri-Erba
Dr Anne J. Kleinnijenhuis
Phospho-specific antibody production
Dr Thorsten Wiederhold
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
PROYECTO DOCENTE
Contenidos de Biología Celular en la licenciatura de Biotecnología
Asignatura
Ciclo
Curso
Cuatr.
Carácter
Créditos
Biologia Celular
1
1
2º
Troncal
6
Cultivos Celulares
2
3
2º
Troncal
4,5
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
OBJETIVOS FORMATIVOS
Objetivo global:
Conocimiento de las técnicas básicas de manipulación de las células en
cultivo y sus aplicaciones en el campo de la biotecnología.
Objetivos específicos:
1. Conocer los principales tipos de cultivos celulares y de tejidos tanto
vegetales como animales.
2. Conocer los métodos de introducción de ADN exógeno en células en
cultivo y saber cómo determinar qué método es el más adecuado.
3. Conocer las principales aplicaciones del cultivo de células y tejidos tanto
vegetales como animales.
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Objetivos específicos:
4.
5.
6.
7.
8.
Ser capaz de leer, entender y comunicar los resultados de un artículo
científico sobre cultivos celulares.
Ser capaz de iniciar un cultivo de células y de tejidos vegetales.
Ser capaz de diseñar un medio nutritivo para el cultivo de células y
tejidos vegetales.
Ser capaz de descongelar y mantener en cultivo una línea celular de
mamífero.
Ser capaz de transfectar células en cultivo y de optimizar el protocolo de
transfección para una línea celular determinada.
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Cultivos celulares
Temario teórico
Tipo
actividad
Descripción resumida de la actividad
Dedicación
(horas)
Objectivo
formativo
TEO
Tema 1. Introducción y técnicas
1
1
TEO
Tema 2. Características y técnicas básicas de los
cultivos vegetales
1
1
TEO
Tema 3. Cultivos de órganos o fragmentos vegetales
3
1
TEO
Tema 4. Cultivo de células vegetales
2
1
TEO
Tema 5. Cultivos vegetales y transformación de plantas
2
2
TEO
Tema 6. Aplicaciones de los cultivos in vitro vegetales
1
3
TEO
Tema 7. Técnicas de manipulación de células animales
en cultivo.
2
1
TEO
Tema 8. Cultivos celulares especializados y técnicas
asociadas.
2
1
TEO
Tema 9. Sistemas de modificación celular.
2
2
TEO
Tema 10. Biotecnología de tejidos.
2
3
TEO
Tema 11. Biotecnología en células animales.
2
3
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Cultivos celulares
Temario práctico
Tipo
actividad
Descripción resumida de la actividad
Dedicación
(horas)
Objetivo
formativo
PRA
Prácticas 1-3: Diseño de una unidad de cultivo de
células y tejidos vegetales. Elaboración y
preparación de medios de cultivo. Iniciación de
un cultivo de tejidos vegetales
8
5-6
PRA
Práctica 4: Organogénesis y regeneración
2
5-6
PRA
Prácticas 5-7: Descongelación y puesta en cultivo de
una línea celular. Ensayo de citotoxicidad.
Transfección de células con PEI: optimización del
protocolo. Congelación de células.
10
7-8
PRO
Estudio de casos: cultivos vegetales
1
4
PRO
Estudio de casos: cultivos animales
1
4
SEM
Seminario: introducción y presentación
1
4
SEM
Seminario: exposición y planteamiento de preguntas
2
4
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
BIBLIOGRAFIA
Bibliografía básica:
COLLIN HA, EDWARDS S. 1998. Plant cell culture. Bios Scientific Publishers.
GAMBORG OL, PHILLIPS GC. 1995. Plant cell tissue and organ culture.
Fundamental methods. Springer Verlag.
TAJI A, KUMAR PP, LAKSHAMANAN P. 2002. In vitro plant breeding. Food
Products Press
ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WALTER P.
2004. Biología Molecular de la Célula, 4ª edición. Editorial Omega, Barcelona.
FRESHNEY RI. 1999. Culture of animal cells. John Wiley & Sons. Ltd.
SPECTOR DL, GOLDMAN RD, LEINWAND LA. 1998. Cells: A Laboratory
Manual. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press cop.
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Bibliografía complementaria:
GEORGE EF. Plant propagation by tissue culture. Part 1 (1993): The
technology. 574p. Part 2 (1996): In practice. 799p. Exegetics Ltd., England.
ENDRESS R. 1994. Plants cell biotechnology. Springer Verlag.
TRIGIANO RN, GRAY DJ. (Eds). 2000. Plant tissue culture concepts and
laboratory
exercises- CRC Press.
Razdan M.K. 2003. Introduction to plant tissue culture. Intercept. UK.
LODISH H, BERK A, MATSUDAIRA P, KAISER CA, KRIEGER M, SCOUT
MP, ZIPURSKY SL, DARNELL J. 2003. Molecular Cell Biology, 5th edition.
WH Freeman and Co., New York. (PubMed)
KARP G. 2002. Cell and Molecular Biology. Concepts and Experiments. 3rd
Edition. John Wiley & Sons. Inc. New York
BONIFACINO JS, DASSO M, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J, HARFORD JB,
YAMADA KM. 2001. Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons.
Ltd.
WILSON L, MATSUDAIRA P. Methods in Cell Biology (series). Academic
Press.
MORGAN JR., YARMUSH ML. 1999. Tissue engineering. Humana press.
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Otras fuentes de información
The virtual library of Cell Biology: http://www.biochemweb.org/methods.shtml
Lecture 15 - Gene Expression in Cultured Cells (Prof Roger L. Miesfeld)
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture15/Lecture15.h
tml
ECACC Handbook:
http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Cell_Culture/Key_
Resources/ECACC_Handbook/Cell_Culture_Techniques_12.html
Tissue culture Methods:
http://userpages.umbc.edu/~jwolf/method5.htm#tc%20methods
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Metodología
Clases teóricas: en las que los alumnos adquieren los conceptos básicos
de la asignatura.
Diapositivas PowerPoint
 Material disponible en la web de la UdL (dossiers electrónicos)
 Pizarra

Análisis de casos: resolución de casos prácticos para la aplicación de los
conceptos teóricos a situaciones reales

Caso real expuesto por el profesor a resolver entre todos.
Seminarios: lectura, comprensión y exposición oral de los resultados de un
artículo científico sobre cutivos celulares. Ayudarán a fomentar el espíritu
crítico y la expresión oral.

Artículo científico a trabajar en grupos de 3 personas
Prácticas de laboratorio: las prácticas permiten la consolidación de los
conceptos teóricos adquiridos y enseña las bases para el trabajo en un
laboratorio de cultivos.

Manipulación individualizada de células en cultivo (grupos de 5 personas)
Cultivos celulares
Ciències Mèdiques Bàsiques
Universitat de Lleida
Evaluación
Se valorará la adquisión de conocimientos, aptitudes y habilidades mediante:
 Examen escrito tipo test sobre la teoría y análisis de casos
 Valoración de la exposición oral del seminario
 Valoración del cuaderno de laboratorio de prácticas
La nota final será:
70% conocimientos teóricos
15% seminario
15% cuaderno de prácticas