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COLTIVAZIONE DEI
MICRORGANISMI
La coltivazione “in vitro” dei
microrganismi
• I sistemi nutritivi vengono chiamati “Terreni di
coltura” o “mezzi o substrati di crescita”.
• Nei Terreni di coltura i microrganismi restano
vitali e si moltiplicano originando popolazioni
di milioni di individui: le colture microbiche.
FATTORI della
CRESCITA MICROBICA
• I microrganismi sono ubiquitari e, pertanto, si
possono prelevare ovunque (alimenti, campioni di
acqua, campioni di suolo, etc.)
• Il trasferimento dei microrganismi dai loro ambienti
naturali nei terreni di coltura origina delle COLTURE
MISTE dato che il microambiente è popolato da
specie microbiche diverse.
• Per poter studiare le caratteristiche delle singolo
specie è importante disporre di COLTURE PURE cioè
di popolazioni geneticamente uguali e derivate da un
un unico microrganismo di partenza.
FATTORI della
CRESCITA MICROBICA
• Per ottenere le Colture pure occorre pertanto usare
delle tecniche particolari per isolare i microrganismi
che ci interessano e porli in coltura pura.
• CLONE o LINEA PURA: è l’insieme di cellule che
derivano per divisioni successive da un’unica cellula
progenitrice.
• CEPPO: è una linea pura di una determinata specie,
isolata da una fonte (habitat) specifica.
• Ciascun ceppo può differire per uno o più caratteri
rispetto al CEPPO TIPO rappresentato dalla coltura
isolata e identificata per la prima volta e utilizzata per
la descrizione della specie.
I Centri di conservazione dei “ceppi tipo”
o Centri di risorse biologiche (BRC)
• I diversi ceppi delle varie specie, compresi i ceppi tipo,
sono conservati da enti specializzati, chiamati Centri di
risorse biologiche (BRC) che hanno il compito di
mantenere le collezioni di microrganismi.
• Praticamente, sono delle banche di microrganismi che
verificano le caratteristiche delle colture e le
conservano, custodendone in tal modo la biodiversità e
la stabilità genetica.
• Una delle principali collezioni internazionali di
microrganismi è l'American Type Culture Collection
(ATCC), fondata nel 1925 negli Stati Uniti, che possiede
una raccolta di ben 18.000 ceppi batterici diversi.
Italia - Perugia: il DBVPG cioè la“Collezione dei
Lieviti Industriali - Industrial Yeasts Collection”
• La Collezione, inizialmente denominata “Collezione dei Lieviti
Vinari dell’Istituto di Microbiologia Agraria e Tecnica” (acronimo
IMAT), è stata fondata all’inizio del 1900 quando la Scuola Superiore
di Agricoltura decise di includere la microbiologia (una scienza
ancora agli inizi) all’interno dei propri corsi di studio.
• Nel 1984, l’Istituto di Microbiologia Agraria e Tecnica (che ospitava
la Collezione IMAT) si fuse con l’Istituto di Botanica, creando il
Dipartimento di Biologia Vegetale. Di conseguenza, la Collezione
IMAT assunse la nuova denominazione di “Collezione dei Lieviti
Industriali - Industrial Yeasts Collection” e l’acronimo fu cambiato
in DBVPG. La sede è situata presso il Dipartimento di Biologia
Applicata dell’ Università di Perugia.
• Indirizzo web: http://www.agr.unipg.it/dbvpg/
COLTURE MICROBICHE DA CEPPI PURI (o ceppi
tipo) DELLE COLLEZIONI INTERNAZIONALI
• Pertanto, invece di prelevare i microrganismi da
campioni naturali, si possono allestire le colture
microbiche a partire dai ceppi puri delle collezioni
internazionali, conservati nella ceppoteca del
laboratorio. Questo offre il vantaggio di sapere quale
specie microbica si sta manipolando, conoscerne le
caratteristiche e soprattutto sapere il livello di rischio
relativo alla manipolazione di un determinato
microrganismo;
• raccogliendo, invece, i microrganismi dai loro habitat
naturali non conoscendo le specie presenti, non si può
escludere che tra di esse vi siano ceppi patogeni.
CRESCITA DEI MICRORGANISMI IN LABORATORIO
SIGNIFICA SODDISFARE LE LORO ESIGENZE VITALI
• Per far crescere i microrganismi in laboratorio e cioè favorire la loro
riproduzione, bisogna soddisfare le esigenze vitali delle singole specie
che, vista l'ampia varietà metabolica dei microrganismi, sono molto
diversificate.
• Molte specie sono state identificate e classificate e ne conosciamo i
caratteri colturali cioè le condizioni ambientali necessarie alla loro
riproduzione e, quindi, alla crescita della coltura.
• Sono caratteri colturali fondamentali:
–
–
–
–
–
–
Fonti di carbonio ed energia,
nutrienti particolari,
temperatura,
presenza o meno dell' ossigeno,
pH (reazione del substrato)
concentrazione osmotica del mezzo.
– Tali caratteri devono essere attentamente considerati
nella preparazione dei cosiddetti TERRENI DI COLTURA.
“…non
tutti i microrganismi riescono a crescere in
laboratorio…”
• Non tutti i microrganismi sono, però, coltivabili in laboratorio. Per
alcuni non si è infatti, riusciti a ricreare, in vivo, le condizioni di
sviluppo degli ambienti naturali, probabilmente per scarse
conoscenze sulle esigenze delle singole specie o per la mancanza
della possibilità, per la specie in esame, di stabilire relazioni
indispensabili con alcune popolazioni, come avviene nelle comunità
naturali. Esempi di microrganismi che non si è riusciti a coltivare in
laboratorio sono molti microorganismi del suolo e anche alcuni
patogeni, come:
– Treponema pallidum (spirocheta, agente della Sifilide) e
– Mycobacterium leprae ((conosciuto anche come Bacillo di Hansen o
BH, bacillo agente eziologico della lebbra)
• Per altri microrganismi la coltivazione risulta molto difficile, come
ad esempio per Heliobacter pilori, batterio responsabile dell'ulcera
gastrica e duodenale.
Microrganismi VBNC:
“Viable but not culturable”, vitali ma non coltivabili
• Si è osservato che alcune specie, normalmente coltivabili in laboratorio,
dopo periodi prolungati di conservazione in laboratorio e permanenza in
condizioni di stress, come ad esempio per scarso apporto di nutrienti o
basse temperature, trasferite in terreni freschi non danno luogo a una
crescita visibile.
• Si è ovviamente pensato che la mancanza di crescita fosse dovuta alla
morte dei microrganismi, ma alcune ricerche hanno evidenziato che le
cellule, "rianimate" con nutrienti o fattori chimico-fisici particolari, erano
vitali, avendo ripreso a riprodursi.
• Questa condizione, la cui genesi non è ancora ben compresa, viene
indicata con l'acronimo o sigla VBNC, dall'inglese Viable But Not
Culturable, cioè vitali ma non coltivabili.
• Essa riguarda diverse specie batteriche, come Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Vibrio vulnificus e Legionella pneumophila.
• Per definizione, un batterio in VBNC è
metabolicamente attivo e allo stesso tempo incapace
di andare incontro a scissione per riprodursi.
• La cellula batterica in VBNC riduce di molto le sue
dimensioni ed assume una forma sferica ("coccica"),
forse per ridurre al minimo le richieste energetiche e
nutritive del metabolismo.
• La "resuscitazione" dal VBNC (cioè il ritorno al
normale stato della cellula che diventa pertanto
“coltivabile”) è un processo stimolato da un fattore
opposto a quello che ha indotto il VBNC; può
richiedere ore o giorni per essere completata.