Transcript 基因的提取纯化与检测

核酸的结构和功能
•核酸是遗传信息传递的载体
•核酸的化学组成及结构
•核酸的功能
•核酸的检测技术
(质粒)
plasmid
Bacterial chromosome
原核细胞
真核细胞
核酸在细胞中的分布
核酸是遗传信息的载体
DNA的一级结构
3
5，
3，5磷酸二酯键（连接）
磷酸基
脱氧核糖
5
OH
3，
碱基
碱基的结构氢键的形成原理
DNA一级结构和二级结构的关系
DNA和RNA的结构差异
主要区别：碱基、核糖
2nm
3，
小沟
5，
大沟
3.4nm
大沟
3，
5，
核
酸
的
立
体
结
构
及
其
特
征
DNA的空间结构
核酸的化学检测原理
•嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核
酸在240-290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值
在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用
紫外分光度计加以定量及定性测定。
•实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测
样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD
值，从/的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的/应为1.8，纯
RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，/比值即明显降
低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。
•通常1OD值相当于50微克／毫升双螺旋DNA，或40微克／
毫升单螺旋DNA(或RNA)，或20微克／毫升寡核苷酸计算。
•对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡
啶溴红染色而粗略地估计其含量。
DNA的变性与复性及其Tm值和cot值测定
•
DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，
形成单链无规则线团，因而发生性质改变(如粘度下降，
沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)，称为
DNA变性。加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂
(如乙醇，尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影响，
均可使DNA变性。
Tm值与增色效应
•
变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm
紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应
(hyperchromic effect) 。 当 温 度 升 高 到 一 定 范 围 时 ，
DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，
随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。通
常人们把50％DNA分子发生变性的温度称为变性温度
（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结
晶 的 熔 解 相 类 似 ， 故 又 称 熔 点 或 熔 解 温 度 (meltin
temperature，Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消
光值一半时的温度。
Tm值和增色效应是目前描述DNA特性所常用的两
个量，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。
DNA的Tm值与以下因素有关：
(1) DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解链发生在很
窄的范围内，而不均一DNA如动物细胞DNA，Tm值的范围
则宽。
(2) DNA分子中（G+C）的含量：一定条件下DNA的Tm值，
由G+C含量所决定，因为G+C之间有3个氢链，因此G+C含
量较高DNA，Tm值较高，二者的关系可用以上经验表示：
(1xssc)
％(G+C) = (Tm一69.3)×2.44
(3) 溶剂的性质：Tm不仅与DNA本身性质有关，而且与溶
液的条件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm值较低，
熔点范围也较宽，离子强度增高时，Tm值升高，融点范围
也变窄。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液
中，一般保存在1mol/L NaCl溶液中较稳定。
问题
•DNA的光谱吸收有何特点，此特点有何应用？
•DNA的稳定性由何决定？
•DNA的多样性由何决定？
•DNA的特异性由何决定？
DNA的复制及复制的真实性
解链
复制 (2n )
再螺旋
母链
子链
参与DNA复制的体系
DNA
复
制
的
过
程
染色体和基因、DNA的关系
内含子和外显子
DNA复制的方式和结果
半保留复制
全保留复制
分散复制
蛋白质的体内合成
DNA
转
录
RNA
(mRNA)
翻
译
?
protein
基因的转录和加工
基因－mRNA-tRNA-蛋白质的关系
DNA功能总结：中心法则