Transcript Wyklad 4

Eksperymenty do wykonania
1. Experiments -> Basic -> Resting potential
Uruchomic model dla domyslnych parametrow.
Zbadac wartosc potencjalu spoczynkowego, dla pna_leak = 0 i pk_leak = 0.
2. Experiments -> Basic -> Resting potential
Zbadac wplyw stężen jonow w przestrzeni wewnatrz i zewnątrzkomorkowej na
wartosc potencjalu spoczynkowego.
Np. co sie dzieje, gdy [K]out = [K]out = 135 mM (0.001 mol/litr) ?
Potencjal spoczynkowy wynosi – 65 mV. Co sie stanie, gdy odwrocimy
koncentracje względem błony?
3. Experiments -> Basic -> Membrane properties
Uruchomic model dla domyslnych parametrow.
Co sie dzieje, gdy podwoimy wartosc pk_leak i pna_leak? Potencjal wzrosnie,
czy zmaleje?
V = IR= I/g g – przewodnictwo, R – opór (input resistance)
4. Experiments -> Basic -> Membrane properties
Uruchomic model dla I = 2nA.
Potencjał czynnościowy
Potencjał czynnościowy polega na krótkotrwałej depolaryzacji
błony komórkowej. Wczesne doświadczenia (K.C. Cole i H. J.
Curtis, 1939) pokazały, że błona komórkowa staje się
spolaryzowana dodatnio (ok. +50 mV) podczas maksimum
potencjału czynnościowego. Gdyby powodował go jedynie
chwilowy wzrost przepuszczalności dla wszystkich jonów,
błona osiągnęła by 0 mV, lecz nie więcej. Obiektem do badań
potencjału czynnościowego był akson Kalmara Atlantyckiego.
Kalmar Atlantycki Loligo pealei
Potencjał czynnościowy – impuls sodowy
Zależność potencjału
czynnościowego od stężenia sodu. A
i B: Maksimum potencjału
czynnościowego maleje wraz
maleniem stężenia Na w płynie
zewnątrzkomórkowym. Silna
zależność wartości maksimum od
stężenia Na wskazuje na duża
przepuszczalność błony dla tych
jonów w trakcie impulsu.
Alan Hodgkin i Bernard Katz odkryli, że amplituda potencjału czynnościowego
zależy od koncentracji Na na zewnątrz komórki. Postawili hipotezę, że chwilowa
zmiana przepuszczalności i wpływ jonów Na do wnętrza komórki powoduje
potencjał czynnościowy. Potwierdzeniem tej hipotezy była obserwacja, że
maksimum potencjału czynnościowego wynosi +55mV, co jest bliskie wartości
potencjału równowagi dla sodu. Ich eksperymenty wskazały również, że zanik
potencjału czynnościowego może być związany ze wzrostem przepuszczalności dla
jonów K i ich wypływem z komórki.
Eksperyment HH
A. Elektroda mierzaca potencjal wewnatrzkomorkowy w aksonie (średnica 500 um). Obraz z przodu i z boku jest
możliwy dzieki systemowi luster.
B. Pierwszy wewnątrzkomorkowy zapis potencjalu czynnosciowego. Sinusoida o czestosci 500 Hz była uzywana
jako znacznik czasu.
Hodgkin AL & Huxley AF (1939). Action potentials recorded from inside a nerve fibre. Nature 144, 710–711.
Potencjał czynnościowy – wszystko albo nic
wzrost gNa
depolaryza
-cja błony
napływ Na+
‘Wybuchowa’ natura impulsu jest związana z kanałami sodowymi o przepuszczalności zależnej od
napięcia i sprzężeniem zwrotnym dodatnim z depolaryzacją błony. Repolaryzacja jest związana z
otwarciem kanałów potasowych i wypływem potasu z komórki.
Voltage clamp
Technika voltage clamp była opracowana przez Kenneth’a Cole’a w 1949 r. Alan Hodgkin i
Andrew Huxley wykorzystał ją w serii eksperymentów (1952) nad mechanizmem generacji
potencjału czynnościowego. Voltage clamp pozwala mierzyć wpływ zmian potencjału
błonowego na przewodnictwa jonowe.
Voltage clamp działa na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego. Potencjał błonowy jest mierzony przez
wzmacniacz (membrane potential amplifier) podłączony do elektrody zewnątrz i wewnątrzkomórkowej. Jest on
przekazywany do wzmacniacza (feedback amplifier). Drugie wejście do wzmacniacza stanowi potencjał z generatora
ustalany przez eksperymentatora (command potential). Wzmacniacz oblicza różnicę napięć i przekazuje sygnał na
elektrodę biegnącą wewnątrz komórki. Prąd potrzebny do utrzymania napięcia na zadanym poziomie jest miarą
prądu błonowego płynącego przez kanały jonowe.
Eksperyment voltage clamp - wyniki
Mała depolaryzacja wywołuje prąd
kondensatora Ic = C dV/dt oraz leak Il.
Większa depolaryzacja wywołuje większy
prąd kondensatora Ic oraz Il oraz
dodatkowo prąd dokomórkowy, a następnie
odkomórkowy.
Depolaryzacja w obecności tetrodoxyny
(TTX) blokującej kanały Na+, a następnie
w obecności tetraethyloammonium (TEA)
blokującej kanał K+, pozwala zobaczyć
‘czysty’ prąd IK i INa, po odjęciu Ic oraz Il.
Eksperyment voltage clamp - wyniki
Prawo Ohma
I K (V, t)
gK (V, t) =
(V - EK )
I Na (V, t)
gNa (V, t) =
(V - ENa )
Znając IK, INa, EK, ENa, oraz V można obliczyć gK i gNa. IK, INa można wyliczyć z pomiarów voltage clamp, EK,
ENa- stałe, V – ustala eksperymentator.
Okładka programu wręczenia Nagrody
Nobla w 1963 r.
dV
I m = Cm
+ I K + I Na + I L
dt
dV
I m = Cm
+ gK (V, t)(V - EK ) + gNa (V, t)(V - E Na ) + gL (V - EL )
dt
HH model - bramki
Pomiary voltage clamp dla różnych wartości V pozwoliły HH postawić hipotezę, że kanał Na posiada
bramkę aktywacyjną i bramkę inaktywacyjną. Obie muszą być otwarte by kanał mógł przewodzić jony.
Bramka aktywacyjna jest zamknięta gdy błona znajduje się poniżej potencjału spoczynkowego i otwiera
się szybko przy depolaryzacji. Bramka inaktywacyjna jest otwarta przy potencjale spoczynkowym i
wolno zamyka się w wyniku depolaryzacji. Kanał K posiada tylko bramkę aktywacyjną otwierającą się
wolno w wyniku depolaryzacji.
Zachowanie
pojedynczych
kanałów może być
rejestrowane za
pomocą patch clamp.
W zapisach widać
szybkie otwieranie i
zamykanie
pojedynczych
kanałów. Ich suma
daje gładki przebieg
wartości prądu
HH model - bramki
Terminologia:
Włączenie prądu: aktywacja, wyłączenie prądu: dezaktywacja: oba procesy związane z
otwarciem/zamknięciem bramki aktywacyjnej.
Gdy prąd się włącza a następnie wyłącza pomimo stałego poziomu błony, oznacza to ze posiada on
bramkę inaktywacją.
Procesy związane z zamknięciem/otwarciem bramki inaktywacyjnej to inaktywacja prądu/deinaktywacja
prądu
Model bramki (gate model – Hodgkin i Huxley (1952))
Zamknięty
a
Otwarty
1-y
y
b
y - prawdopodobieństwo, że bramka jest
w stanie otwartym, 1-y – że w stanie
zamkniętym, a, b – stałe szybkości.
Zakładamy kinetykę reakcji pierwszego rzędu:
dy
 a (1  y )  by
dt
W stanie ustalonym:
dy
 0  a (1  y )  by
dt
Stąd:
y 
a
a b
Podstawiając do równania:
dy
 a (1  y )  by  a  (a  b ) y  y (a  b )  (a  b ) y
dt
 (a  b )( y  y )
Model bramki (gate model – Hodgkin i Huxley (1952))
Całkując dostajemy:
ò
dy(-1)
= (-1) ò (a + b)dt
(y ¥ - y)
ln(y ¥ - y) = -(a + b)t
y = y ¥ - Ae -(a + b )t
a (V )
y¥ (V ) =
a (V ) + b (V )
1
t (V ) =
a (V ) + b (V )
stan ustalony
stała czasowa
Zależność stałych czasowych i prawdopodobieństwa w stanie ustalonym od napięcia dla kanałów napięciowozależnych
aktywowanych depolaryzacja (lub inaktywowanych hiperpolaryzacją).
HH model
HH zauważyli, że gK i gNa nie są funkcjami exp(-t/t) lecz raczej potęgami funkcji ekspotencjalnych.
Zaproponowali:
gK (V , t )  YK (V , t ) g K  n4 g K
gNa (V , t )  YNa (V , t ) g Na  m3h g Na
Korzystając z modelu bramki:
dn
an
1
 a n (1  n)  b n n, n 
, tn 
dt
a n  bn
a n  bn
dm
am
1
 a m (1  m)  bm m, m 
, tm 
dt
a m  bm
a m  bm
dh
ah
1
 a h (1  h)  b h h, h 
, th 
dt
a h  bh
a h  bh
HH model
Z przebiegów gK i gNa HH wyznaczyli:
a n , bn , a m , bm , a h , bh
an =
n¥
tn
,
am =
m¥
ah =
h¥
tm
th
bn =
1- n¥
tn
, bm =
, bh =
1- m¥
tm
1- h¥
th
t n , t m , t h , n , m , h
a następnie obliczyli:
HH model
a n , bn , a m , bm , a h , bh
Następnie, do
a n (V ) = 0.01(-V +10) / (e
bn (V ) = 0.125e
-V
18
a h (V ) = 0.07e
bh (V ) = 1 / (e
-1)
-V
80
a m (V ) = 0.1(-V + 25) / (e
bm (V ) = 4e
-V +10
10
-V
20
-V +30
10
-1)
-V +25
10
-1)
dopasowali funkcje:
HH model
Ostatecznie, model Hodgkina i Huxleya można zapisac:
dV
I m = Cm
+ gK n 4 (V - EK ) + gNa m3h(V - ENa ) + gL (V - EL )
dt
HH rozwiazali numerycznie swoje równania na mechanicznym kalkulatorze i
otrzymali bardzo dobrą zgodność z doświadczeniem
model
eksperyment
A. Obliczony (góra) i rzeczywisty (dół) potencjał czynnościowy w aksonie kalmara.
B. Kalkulator mechaniczny (Brunsviga Maschinenwerke, Grimme, Natalis & Co) w laboratorium Alana Hodgkina w
Cambridge.
Generacja potencjału czynnościowego - podsumowanie
Charakterystyka typowego kanału
activation gate
inactivation gate
1
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
-100
-80
-60 -40
mV
tau activation
0
-20
-100
-80
-60 -40 -20
mV
tau recovery and inactivation
-100
-80
15
300
ms
ms
10
5
0
200
100
-100
-80
-60
mV
-40
-20
0
-60
mV
-40
-20
Eksperymenty do wykonania
5. Experiments -> Basic -> Impulse generation
Zbadac wplyw stężen jonow w przestrzeni zewnątrzkomorkowej na generacje
potencjalu czynnosciowego (Na, K, Cl, Mg, Ca).
Ktore jony maja decydujacy wplyw?
Obnizyc poziom [Na]out i skompensowac to za pomoca Base current.
Jaki wplyw ma [Na]out na potencjal spoczynkowy i na potencjał czynnosciowy?
Obnizyc poziom [K]out i skompensowac to za pomoca Base current.
Jaki wplyw ma [K]out na potencjal spoczynkowy i na potencjał czynnosciowy?
Porównac hyperpolaryzacje po potencjale czynnosciowym dla warunkow
normalnych i niskiego [K]out.
6. (Eksperyment ‘Pasta do zębów ’) Przywrócić poziom [K]out i obnizyc
poziom [K]in (0.1 mM). Skompensowac zmiane potencjalu spoczynkowego za
pomoca ujemnego base current (-3nA). Pobudzic komorke. Co sie dzieje?
Eksperymenty do wykonania
7. Experiments -> Currents -> Fast Na, K -> voltage clamp
Analiza voltage clamp pradow Na i K
Zadac krok napiecia 0 – 10 sek: -65 mV, 10 – 20 sek: 0 mV.
Narysowac prad calkowity, prad INa oraz IK (za pomoca Plot what ->soma ->
INa, IK).
8. Analiza voltage clamp pradow Na i K: obejrzec osobno prądy INa, IK poprzez
wyrownanie stezen, po obu stronach blony lub poprzez ustalenie przewodnictw na 0.
Eksperymenty do wykonania
9. Zbadac zaleznosc pradow INa i IK od napiecia w ekperymencie voltage clamp.
Otrzymac nastepujacy rysunek:
Eksperymenty do wykonania
10. Experiments -> Currents -> Fast Na, K -> amplitude and time course
Analiza voltage clamp pradow Na i K. Obejrzec i zrozumiec przebieg zmiennych
m, h, n oraz prądów INa i IK.