Transcript Clostridium sp

OPTION EQUINE
II – SYSTEME DIGESTIF
1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES
2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE
Annick Linden
Service de Bactériologie
Dpt. des Maladies Infectieuses et Parasitaires
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
2. Poulain
3. Adulte
4. Diarrhées induites par les ATB
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique
- Clostridium sp
2. Poulain
- Salmonella sp
- Clostridium sp
- Rhodococcus equi
- E coli
- Campylobacter
- Streptococcus durans
- Bacteroides fragilis
3. Adulte
- Salmonella sp
- Clostridiose
- Colitis "X"
- Potomac Horse Fever
4. Diarrhées induites par les ATB
CAUSES INFECTIEUSES RESPONSABLES DE
MORT BRUTALE (< 24 H) CHEZ LE CHEVAL
Shaker-foal syndrome
Hépatite chez le poulain
Septicémies néonatales
Septicémies chez l’adulte
Clostridium botulinum (type B)
Clostridium piliforme (Tyzzer’s disease)
Actinobacillus equuli
E coli, Salmonella sp
Bacillus anthracis, …
Entérotoxémies
Clostr perfringens, difficile, sordellii
Myopathies d’origine clostridienne
Clostr septicum, chauvoei, novyi,perf,
Colite aiguë et csq
Colitis « X »
Hémorragie poches gutturales
Neo risticii, Salmonella sp
Clostridium sp
Mycose
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
Nv-né
- Septicémie : E coli, Actinob. sp, Salm
- Clostridium sp
1 – Actinobacillus equuli
" Maladie du poulain triste " (avt : Shigellose du poulain)
Changements récents dans la taxonomie
Actinobacillus equuli subsp equuli
Actinobacillus equuli subsp haemolyticus (taxon 11 de Bisgaard)
Coccobacilles Gram nég, aéro-anaérobies
coloration bipolaire, immobiles, non sporulés
gélose au sang, 5 % CO2
A equuli equuli : col visqueuses, adhérentes, non hémo
A equuli haemolyticus : hémolytiques
Actinobacillus equuli equuli
Bactéries commensales muqeuses (Resp et Dig) des chevaux
---- Pathogènes opportunistes
Souches flore normale = Souches isolées de lésions
A. equuli equuli : Cv (poulain, adulte), porc
A. equuli haemolyticus : que chez les chevaux (poulain, adulte)
Actinobacillus sp
Septicémies néonatales chez le poulain :
Actinobacillus sp est une cause de mortalité fréquente
Contexte de septicémie : transfert immunité passive ?






Début brusque : 24-48 H
Poulain fort abattu, refuse de têter
Fièvre n’est pas constante
Diarrhée et troubles respiratoires
Articulations douloureuses
Arthrites fréquentes si survie
 Tableau parfois discret (cfr MIGA) : diagnostic précoce difficile
Actinobacillus sp
DIAGNOSTIC ANTE MORTEM
Diagnostic précoce = ttm précoce = meilleur pronostic
Clinique
« Score septique » : WBC, fibrinogène, glycémie, IgG
Hémocultures : OK en théorie mais :
matériel adéquat
plusieurs hémocultures nécessaires/24h
risque de faux négatifs
interprétation des résultats
24 - 48H pour avoir les résultats
DIAGNOSTIC POST MORTEM
Lésions macro
Prélèvements de choix : reins, poumons
Diagnostic précis : confusion possible avec Pasteurella
Actinobacillus sp
Traitement (Actinobacillus sp)
Péni-Genta
TMP/S
Céphalosporines III G
Etude en Suède
97 % des souches Act sensibles à
92 %
90 %
85 %
49 %
TMP/S
Ampi
Péni
Genta
Strepto
Prévention
Pas de vaccins commerciaux
Mesures d'hygiène (accouchement), colostrum !
Actinobacillus sp
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique
- Clostridium sp
2. Poulain
- Salmonella sp
- Clostridium sp
- Rhodococcus equi
- E coli
- Campylobacter
- Streptococcus durans
- Bacteroides fragilis
3. Adulte
- Salmonella sp *
- Clostridiose *
- Colitite "X"
- Potomac Horse Fever
* Diarrhées induites par les ATB
2 - Clostridium sp
 Clostridium tetani
 Clostridium botulinum




Clostridium perfringens
Clostridium sordellii
Clostridium difficile
Clostridium cadaveris
Sphère
Digestive
Clostridium perfringens
Bâtonnets réguliers Gram +, anaérobies, sporulés
Toxines majeures
Toxines mineures
a
b1
b2
e
i
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Photos
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Photos
Clostridium perfringens
a
b1
e
i
entérotoxine
A
+
-
-
-
+/-
B
+
++
+
-
-
C
+
++
-
-
-
D
+
-
++
-
-
E
+
-
-
+
-
Poulain :
Adulte :
toxinotypes B et C
toxinotype A
5 DIFFERENT TOXINOTYPES
MINOR TOXINS
MAJOR TOXINS
a b e i
d q k l m N n h g
A
+ -
- -
- + + - + + + + - - +
B
+ + + -
+ + + + + + + - + + +
C
+ + - -
+ + +
D
+ -
+ -
- + + + + + + - - - +
E
+ -
- + - + + + + + + - - - -
TOXINOTYPES
VEGETATIVE PHASE
he
Ent
+ + + - + - +
SPORULATION PHASE
TOXINS
C. SEPTICUM
C. SORDELLII
C. PERFRINGENS
DIGESTIVE TRACT
C. DIFFICILE
Clostridium sp chez le poulain
(1) C. perfringens Type B et C surtout (toxine b sensible à la trypsine)
Susceptibilité du nv-né (absence de protéases intestinales
et inhibiteur de trypsine dans colostrum)
Sporadique sauf exception
Poulain de 1 ou 2 jours
Soit mort brutale
Soit signes systémiques, diarrhée hémorragique et mort en 2 J
Diagnostic
- lésionnel : entérite hémorragique nécrosante
- bactériologique : aspect quantitatif !
Traitement (cibler surtout déshydratation)
- Si ATB: métronidazole (cfr législation), Péni
- Probiotiques (compétition de flore : Clostr versus Lactobacillus sp)
TOXINOTYPE C (a, b)
IN NEWBORN ANIMALS
Photos
TOXINOTYPE C (a, b)
IN NEWBORN ANIMALS
A
B
S
E
N
C
E
O
b TOXIN TRYPSIN SENSITIVE (anti-trypsin activity in colostrum)
ABSENCE OF NORMAL INTESTINAL FLORA
BRUTAL DIET CHANGES ARE RISK FACTORS
TOXINOTYPE C : a, b
Photo
ENTERITIS NECROTICANS IN HUMAN
+ MINOR TOXINS
Clostridium sp chez le poulain
(2) C. difficile chez des poulains avec/sans ATB
poulains de 3 à 5 jours, cas mortels
entérite hémorragique nécrosante
mise en culture délicate, milieux spécifiques
Larges bâtonnets à Gram +, anaérobies stricts, svt mobiles
Spores subterminales, ovales et déformantes
Bactérie ubiquitaire sols, eaux, flore intestinale, …
milieu hospitalier : spores !!
désinfectants à base d’hypochlorite
TOXINES
Toxine A (entérotoxine) : cfr diagnostic
Toxine B (cytotoxine)
Toxine binaire
Clostridium sp chez le poulain
(2) C. difficile
• Nombreux poulains ( < 14 J) sont porteurs
de Clostridium difficile !
Clostridium sp chez l'adulte
1. Clostridiose intestinale
Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris
Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB ..)
Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë
Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo)
Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines
2.
3.
a TOXIN = PHOSPHOLIPASE C
ATTACKS CELLS MEMBRANE
CELL DEATH
erythrocytes, platelets, leukocytes,
endothelial and muscle cells, …
a toxin
Photos
POUR INFO ……
A NOVEL TOXIN : B2 TOXIN
• NECROTIC ENTERITIS IN PIGLETS (GIBERT ET AL. 1997)
b2 PURIFIED FROM C. PERF TYPE C
Photos
B2 TOXIN
• PROTEIC MAJOR EXOTOXIN (265 Aa, 28 kDa)
• LETHAL FOR MICE AND TOXIC FOR CELLS IN
CULTURE
• APPARENT PROTEIN INSTABILITY
• Cpb2 GENE IS PLASMIDIC (MOBILITY)
• C. PERF TYPE A (++), C, D, E, (B)
• Cpb2-POSITIVE STRAINS (C.PERF TYPE A) ASSOCIATED
WITH ENTERITIS :
–
–
–
–
–
IN PIGLETS
IN HORSES
IN DOGS
IN CATTLE
….IN ELEPHANT
(GARMORY ET AL, 2000)
(HERHOLZ ET AL, 1999)
(THIEDE ET AL, 2001)
(BACCIARNI ET AL, 2001)
CAUSE-AND-EFFECT RELATIONSHIP ??
GENE IS PRESENT BUT TOXIN ??
PIGS
OK
• HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN NEONATAL PIGS
WITH ENTERITIS (91.8% VERSUS 11.1 % FROM HEALTHY PIGS)
• AND HIGH CORRELATION OF GENOTYPE WITH
PHENOTYPE (> 96.9%) (BUESCHEL ET AL, 2003)
HORSES
• HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN HORSES WITH
TYPHLOCOLITIS (HERHOLZ ET AL, 1999)
• GENOTYPE/PHENOTYPE ? IMMUNOHISTOCHEMISTRY
NEEDS FURTHER INVESTIGATION (BACCIARINI ET AL, 2003)
Clostridium sp chez l'adulte
1. Clostridiose intestinale
Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris
Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB ..)
Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë
Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo)
Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines
2. Colite "X"
Etiologie non déterminée
Forte suspicion d'implication des Clostridies (entérotoxémie)
Fort semblable au tableau de clostridiose mais évolution plus rapide
Pronostic négatif
3. Clostridiose ATB – induite
C. perfringens, C. difficile
Clostridium sp chez l'adulte
Cas particulier de Clostridium difficile
Médecine humaine : principale cause de diarrhée post ATB
infection nosocomiale (spores en milieu hospitalier !)
Médecine équine : importance croissante de C. difficile ( diagn ++)
Clostridium sp chez l'adulte
Clostridium difficile
Médecine équine : thèse V. Baverud (Suède, 2002)
(1) Colites aiguës et fatales chez cv adultes
- groupes à risque :
cv hospitalisés et traités ATB
juments dont poulains traités erythro/rif
(2) Exp. Erythromycine induit colite sévère avec prolifération de C.difficile
(3) Portage fréquent de C. difficile chez des poulains sains (<15J)
réservoirs ?
(4) Milieu ext : fermes d’élevage > centres d’entrainement
Clostridium sp chez l'adulte
Clostridiose ATB – induite
Cas particulier de Clostridium difficile
Clinique : coliques, diarrhée parfois hémorragique, déshydratation
Diarrhée peut débuter pdt ATB ttm ou qques J après
Prudence si cas de diarrhée : envrnmt contaminé +++
Lésions : entérite hémorragique nécrosante
Diagnostic : prélèvements répétés de MF
(1) Mise en culture rapide, milieu sélectif CCFA (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar)
(2) Détection toxine : conserver MF à 4°C car dénaturation rapide
kits commerciaux
Traitement : Métronidazole reste ATB de choix
Diagnostic
 Clinique : Clostridies :
diarrhée (+/-)
toxémie
 Bactériologique
 Anaérobiose
 Milieux sélectifs
 Comptages !!
 si post mortem : délai minimum entre mort de l'animal –
prélèvement et mise en culture
CLOSTRIDIUM PERF IN HORSES
MANAGEMENT IMPROVEMENT
SHIFT OF INTESTINAL FLORA
RISK FACTORS
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique
- Clostridium sp
2. Poulain
- Salmonella sp
- Clostridium sp
- Rhodococcus equi
- E coli
- Campylobacter
- Streptococcus durans
- Bacteroides fragilis
3. Adulte
- Salmonella sp
- Clostridiose
- Colitite "X"
- Potomac Horse Fever
4. Diarrhées induites par les ATB
3 - Salmonella sp
 Réceptivité : poulain nv-né, poulain sevré et adulte
 Importance des facteurs favorisants
 Infection nosocomiale
 Certains sérovars prédominent dans un envrnmt donné




Problématique des porteurs asymptomatiques
Emergence rapide de souches ATBrésistantes
Résistance des Salmonella dans le milieu extérieur !!
CONDITIONS D'HYGIENE
Salmonellose équine
 Septicémie
 Entérite aiguë
 Entérite chronique
Caractéristiques






Nomenclature des Salmonelles !
Une seule espèce : Salmonella choleraesuis
7 sous-espèces dont S. choleraesuis subsp choleraesuis
Nombreux sérovars ( > 2200) : Ag O, Ag H (et Ag Vi)
Sérovars les plus fréquents chez le cheval :
S. typhimurium, S. hadar, S. anatum, S. agona, S. newport, ..
( nomenclature en raccourci !)





Coccobacilles Gram nég, mobiles, Aérobie, cat +, O/F : F
Gassner +, fermentation lactose -, Ox Milieux d'enrichissement (tétrathionate), 42 °C
Tests d'agglutination rapide sur lame
Galeries biochimiques de confirmation, PCR
Facteurs favorisants
 Environnement contaminé
sol ( 1 an), crottins séchés ( > 2,5 ans !), eau ( > 9 mois)





Dose infectante
Stress
ATB (dérive de flore)
Virulence de la souche
Statut immun
à haut risque : Milieux hospitaliers !
Clinique – forme gastro-intestinale
cfr cours MIGA
Souvent 1 à 2 jours avant diarrhée :
Abattement – anorexie – et sy associés à l'endotoxémie
Hyperthermie ++++
Episodes de coliques – constipation
Diarrhée : profuse, liquide, malodorante, pfs hgique
Déshydratation rapide
Tableau variable depuis entérite légère à mortelle
Diarrhée peut durer plusieurs semaines
Passage à chronicité possible
Lésions
Ulcères gastriques (infarcti veineux – toxine)
Typhlo-colite aiguë, hémorragique, pseudomembraneuse
foyers nécrotiques foie – rate
Infarcti niveau colon (cfr prolapsus rectal)
Diagnostic
 Clinique : CV diarrhée aiguë ou chronique : toujours
effectuer une recherche Salmonella
 Bactériologique ( ante mortem )
 Prélèvement précoce (Salm ++ avant diarrhée)
 Prélever dans le rectum (raclage de muqueuse rectale)
 Biopsie rectale possible si Mat féc négatives
 Conserver au frigo – 2 à 3 jours OK
 Multiplier les prélèvements !
 Ne jamais conclure sur base d'un seul résultat négatif
 Prévenir le labo d'une demande Salmonella
Conseillé : 5 prélèvements à 1 jour d'intervalle
Diagnostic
 Clinique
 Bactériologique ( post mortem )
 Caecum, colon, iléon (contenu et contenant)
 Ganglions mésentériques
Traitement
 Fluidothérapie = N°1
 ATBthérapie : controversée !
 AINS
Si ATBthérapie décidée :
TMP/S, Ampi, AG, Céph
ATBrésistances fréquentes et émergence rapide (plasmides)
toujours réaliser un ATBgramme
cfr rapports du CERVA
Pronostic
Prévention et contrôle
 Cv infectés en zone d'isolement
 Conditions d'hygiène +++++
Bottes, tabliers, matériel, ...!
Salmonella résistent à la dessication
Nettoyer (eau chaude sous pression) aussi important que désinfecter
(ammonium 4°, crésol), fumigation,
Attention débris organiques dans pédiluves
 Porteurs asymptomatiques (10 à 20 % des cv)
 Excréteurs actifs (plusieurs semaines après guérison)
conseillé : 5 cultures fécales négatives pour affirmer que le cv n'est
plus excréteur actif
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique
- Clostridium sp
2. Poulain
- Salmonella sp
- Clostridium sp
- Rhodococcus equi
- E coli
- Campylobacter
- Streptococcus durans
- Bacteroides fragilis
3. Adulte
- Salmonella sp
- Clostridiose
- Colitite "X"
- Potomac Horse Fever
4. Diarrhées induites par les ATB
4 - Rhodococcus equi chez le poulain
forme gastro-intestinale de rhodococcose
associée ou non à la forme pulmonaire
douleur abdominale, perte de poids, diarrhée
isolement de Rh equi dans M féc : pas un indice de diagnostic
déterminer virulence des souches (plasmide de virulence)
cfr diagnostic et ttm de la forme pulmonaire
5 - E coli (cfr septicémie)
6 - Campylobacter : rôle controversé
7 - Streptococcus durans
8 - Bacteroides fragilis
DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES
1. Nv-né
- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique
- Clostridium sp
2. Poulain
- Salmonella sp
- Clostridium sp
- Rhodococcus equi
- E coli
- Campylobacter
- Streptococcus durans
- Bacteroides fragilis
3. Adulte
- Salmonella sp
- Clostridiose
- Colitite "X"
- Potomac Horse Fever
4. Diarrhées induites par les ATB
9 - Potomac horse fever
Neorickettsia risticii (ancien nom : Ehrlichia risticii)
Fièvre équine du Potomac (Rivière dans le Maryland, USA)
Identifiée en Am Nord et certains pays Am Sud, suspectéee en Europe
Postulat de Koch rempli
Transmission via ingestion de trématodes infectés (hypothèse)
Localisation intracellulaire (monocytes, macrophages, cellules
épithéliales intestinales)
fièvre, anorexie, oedème des membres, fourbures très fréquentes
typhlocolite et diarrhée (sévérité variable)
avortements possibles
taux de mortalité jusqu'à 30 %
diagnostic sérologique en routine aux USA
traitement : tétracyclines (!)
Vaccins inactivés disponibles aux USA (efficacité discutable à cause de
l'hétérogénéité des souches)
OPTION EQUINE
II – SYSTEME DIGESTIF
1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES
2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE
Annick Linden
Service de Bactériologie
Dptmt des Maladies Infectieuses et Parasitaires
Flore intestinale chez le cheval
Salmonella spp
E coli
Lactobacillus
Rhodococcus spp
Streptococcus spp
Staphylococcus spp
E coli
Salmonella spp
Clostridium perfringens
Streptococcus spp et Enterococcus spp
1. SAMPLING PROCEDURES : ANTE – POST MORTEM
2. BACTERIOLOGIC ANALYSIS
 DIRECT SMEARS
 QUALITATIVE APPROACH
 QUANTITATIVE APPROACH (Clostr)
1. DIRECT SMEARS (SHIFT OF THE FLORA ?)
Photo
Bacterio
2 - Approche qualitative
– Aérobiose
–
37°C – 24H
– Anaérobiose
–
–
37°C – 24H
80%N2 – 10%CO2 – 10% H2
- Columbia Agar 5% sheep blood
- Gassner
- Enrichissement tétrathionate
- Agar au sang sans ATB
- Agar au sang + polymyxine B
- Agar au sang + cyclosérine
– Confirmation d’identité
- Galeries biochimiques API 20E et Rapid ID32A
Bacterio
3 - Approche quantitative – Clostridium sp
Matières fécales
Dilutions successives (10-1 à 10-6)
Ensemencement
Incubation (aérobiose et anaérobiose)
Dénombrement des colonies
cv > 103 CFU/ml contenu intestinal
bv > 106 CFU
.. .. ..
. ... ...
. ..
Photo étuve anaérobique
SAMPLING PROCEDURES
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Photo
- LIGATED INTESTINAL PORTION (20 CM)
- AS SOON AS POSSIBLE TO THE LAB, ON WET ICE
- FREEZING IS AN ALTERNATIVE BUT NOT IDEAL
TO THE LAB WITHIN A FEW HOURS
QUANTITATIVE APPROACH ( C. PERF)
CULTURES IN ANAEROBIC CHAMBERS OR JARES
COUNTS OF CFU ( BY SERIAL DILUTIONS )
IN HORSE :
ABNORMAL COUNT IF > 103 CFU C. PERF/ ML OF INT CONTENT
Interpretations must be taken with caution
QUALITATIVE APPROACH ( C. PERF)
IDENTIFICATION OF THE BACTERIA
IDENTIFICATION OF THE TOXINS INVOLVED
1. TOXIN DETECTION
- FROM GUT CONTENTS OR CULTURE SUPERNATANTS
- IN VIVO TESTS
- ENZYME IMMUNOASSAYS (COMMERCIAL KITS)
- LABILITY OF TOXINS
2. GENE
DETECTION
- MULTIPLEX PCR
- GENOTYPE VERSUS PHENOTYPE ?
ENTEROTOXEMIA
DIAGNOSIS
IDEAL SITUATION
•
•
•
•
SUDDEN DEATH
ACUTE HEMORRHAGIC SEGMENTAL ENTERITIS
BACTERIAL QUANTITATION WITHIN A FEW HOURS
COUNTS > 10 3 CFU/ML ( HORSE )
• TOXIN DETECTION ( ELISA AND PCR)
DIAGNOSTIC IN A GLOBAL APPROACH
Photo entérite hémorragique segmentaire
Photos
En bref .......et tout système confondu
1 - Lawsonia intracellularis
2 - Clostridium piliforme
3 - Taylorella equigenitalis
1 - Lawsonia intracellularis (pour information)
Bacille Gram nég, acido-résistant, non sporulé
cultivable sur cellules intestinales de rat
in vivo, dans le cytoplasme apical des entérocytes
responsable des entérites prolifératives du porc
décrit également chez le cheval
Diagnostic :
- Histopathologie : coloration de Warthin-Starry
- Immunofluorescence et PCR (muqueuse iléon)
2 - Maladie de Tyzzer – Clostridium piliforme
Hépatite chez le poulain - premières semaines de vie
Clostridium piliforme ( ancnmt : Bacillus piliformis)
Bacille intracellulaire, sporulé, non cultivable sur milieux inertes
Tableau variable : fièvre, dépression, anorexie, ictère, diarrhée, ..
Souvent poulains trouvés morts sans signes prémonitoires
Transmission féco-orale : ingestion de spores
Hépatite nécrosante multifocale
Diagnostic histopathologique : coloration de Warthin-Starry
Traitement décevant (Pén, Erythromycine)
3 - Métrite contagieuse équine – Taylorella equigenitalis
Liste B de l'OIE
Infection sexuellement transmissible
Etalon: porteur asymptomatique (fourreau, fosse urétrale, urètre, sperme)
Jument : endométrite (formes chroniques csq fécondité)
Importance économique, entrave aux échanges commerciaux
Coccobacille à Gram nég, non sporulé, micro-aérophile
Conditions optimales de culture ( gélose chocolat, 7 % CO2)
Diagnostic – Ecouvillons pour bactéries anaérobies (AMIES charbon)!!
Mesures réglementaires concernant techniques d'écouvillonnage
(cfr sites précis de prélèvmt) et modalités de mise en culture.
Ecouvillons transmis au labo (agréé) dans les 24 heures !
merci de votre attention