DCM1/ 2009-2010/ Hématologie fondamentale

Mécanismes de l’Oncogénèse en hématologie (2ème partie)

Pascale CORNILLET-LEFEBVRE Laboratoire d’Hématologie

Homéostasie <=> Régulation de la survie, la prolifération, la différenciation, la mort, des interactions cellulaires des CSH

Cellules du Stroma médullaire

Adhésion Régulation

Cellules

Prolifération Différenciation Apoptose

Facteurs solubles de

régulation

Caractéristiques d’une cellule tumorale

Cellules du Stroma médullaire adhésion ---

Cellules

Prolifération + +

Transplantée souris Nude => tumeur

Différenciation - - Facteurs solubles de régulation (insensible) Apoptose - - -

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (1) ACQUISES : par opposition aux anomalies constitutionnelles,héritées => uniquement retrouvées dans les cellules tumorales SPONTANEES : erreur de la DNA Polymerase FAVORISEES : => hémopathies « de novo » par de facteurs génétiques (voir diapo suivante) par des facteurs extrinsèques : chimiothérapie/radiothérapie/ pesticides/benzène/radiations ionisantes => hémopathies secondaires

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (1 bis) CONTRÔLEES par des systèmes de sauvegarde : Systèmes intrinsèques : Systèmes préventifs ex fonction d’édition DNA Polymerase Systèmes palliatifs ex code génétique dégénéré Systèmes curatifs de réparation reconnaissance / réparation Immunosuppression (thérapeutique ou virale) Systèmes extrinsèques : le système immunitaire cellules et leur capacité de produire des cytokines

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (2) MULTIPLES (cancer = processus multi-étapes)



1 événement génique nécessaire mais non suffisant Ex du rôle nécessaire mais non suffisant du remaniement bcl2-JH de la t(14;18) à l’origine d’un lymphome (folliculaire) modèle animal de souris transgénique Présence du remaniement bcl2 JH chez les témoins «sains » identifié par PCR hypersensible Hyperplasie rate et gg (polyclonale) Lymphome monoclonal (seulement après un délai de plusieurs mois et avec remaniement de cmyc retrouvé dans 7/10) Le remaniement de bcl2 en favorisant la survie des cellules favorise la survenue d’événement mutationnel surajouté.

Leucémogénèse internet CHU de Rennes

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (3) NON ALEATOIRES (récurrente) : Une anomalie spécifique primaire Elle est associée à l’ est à l’origine d’un type d’ hémopathie initiation

(preuve fournie par des modèles de souris immunosupprimées transfectées par des virus contenant le remaniement étudié)

du processus tumoral Certaines anomalies à une anomalie primaire de tel ou tel type.

Elles sont secondaires associées à l ’évolution , sont souvent associées la progression d’une hémopathie.

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (3 bis) Cellule Normale

Cmyc Autres ?

Bcl2-JH = t(14;18)

Hyperplasie folliculaire Lymphome folliculaire

Délétion /mutation p53 Mutations bcl2 Activaton cmyc Réarrangement bcl3

Lymphome diffus à grandes cellules agressif Leucémie Myéloïde Chronique

Bcr-Abl = t(9;22) Dup Phi Trisomie 8 Trisomie 19 i(17)q -7 -Y +17 +21 Anomalie 3 Anomalie spécifique Ex : t(15;17)

Leucémie Aiguë

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (4) Cellule atteinte : une Cellule Souche Hématopoïètique (CSH) ou un Progéniteur Hématopoïétique

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (4bis) CLONALES = se produisant dans une cellule puis se propageant à l’ensemble des cellules filles qui en sont issues par division cellulaire (clone cellulaire de cellules identiques)

Comment a-t’on pu identifier l’atteinte clonale de la CST dans la LMC ?

LMC : atteinte clonale de la CST = argument cytogénétique t(9;22) Présence de l’anomalie de l’ADN caractérisant cette hémopathie [t(9;22)] dans toutes les lignées même lymphoïde B

LMC : atteinte de la CST = argument clinique Évolution en LA M Évolution en LA L

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (5) CIBLES des anomalies : les PROTO ONCOGENES anomalie doit porter sur une gène dont le rôle « physiologique » dans le maintien de l’homéostasie de la cellule est primordial. CONSEQUENCE de l’anomalie : PROTO ONCOGENE



ONCOGENE dérèglement du gène en question qui va être à l’origine de l’initiation et/ou du développement d’un processus tumoral

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (6) NATURE des « ONCOGENES » :

Gènes impliqués dans la transmission du signal mitotique :

ex : tyrosine kinase (Abl) ex : facteur de transcription (cmyc) Gènes impliqués dans la différenciation ex : facteurs de transcription (Rara)

Gènes impliqués dans le cycle cellulaire :

ex : cycline (bcl1)

Gènes impliqués dans l’apoptose

: ex : bcl2

Gènes de régulation de prolifération, ou de différenciation ou d’apoptose = ANTI-ONCOGENE :

ex : p53

ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (7) NATURE de l’anomalie Translocation +++ Inversion Délétion

=> Points de cassure et « remaniement » FLT3 : 20% Ras : 15%

Mutation

Amplification Ckit : 30% LAM CBF Autres

t(7;17) del(17)(p) Exemples donnés pour les LAM

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : Généralités Juxtaposition de deux gènes de fusion => transcrit puis protéine bcr-abl de la t(9;22) Pml-Rara de la t(15;17)

Anomalie qualitative Hyperexpression :

Mutation Ex : Jak2 V617F Ex : FLT3-ITD Amplification

Ex: cmyc

Juxtaposition d’un gène à un élément régulateur => dérégulation transcriptionnelle (gène des Ig et RTAg) bcl2-JH de la t(14;18) myc-JH de la t(8;14)

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : Conséquences

Cellules

Prolifération + +

Bcr-abl t(9;22) LMC jak2 V617F PV

Différenciation - - -

PML-RARA t(15;17) LAM3

Apoptose - - -

Bcl2-JH t(14;18) L Folliculaire

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex

bcr-abl LMC :

•Anomalie de la CS •Syndrome myéloprolifératif •Prédominant sur (SMP) la lignée granuleuse •Evolution en 3 phases cliniques : 1- phase chronique (4 ans) hyperleucocytose qui augmente progressivement 2- phase d’accélération :

la t(9;22)

accélération de l’ hyperleucocytose majoration de la blastose 3- phase aiguë transformation en LA •De bon pronostic car TTT ciblé très efficace •Association constante avec une anomalie chromosomique :

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex

bcr-abl

Abl = activité thyrosine kinase (TK) SH3 site de fixation de la protéine qui inhibe l’activité TK de Abl en SH1 Bcr = rôle inconnu

Bcr/Abl = transcrit de fusion à l’origine d’une protéine chimère

Juxtaposition de bcr au domaine SH3 d’Abl => inhibition de la trans-inhibition physiologique d’Abl



exacerbation de l’activité TK d’Abl (constitutive)



Activation des voies de signalisation de la CST



prolifération excessive

ONCOGENESE : Conséquences d’une anomalie : ex

bcr-abl

Mais également : Défaut d’adhésion médullaire (MEC) des progéniteurs Phi+ au stroma Résistance aux stimuli de l’ apoptose Instabilité génétique => acutisation LAL/LAM hypothèse : expression de protéines réparatrices diminuée par bcr/abl => mutation/délétion (p53)

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex

Jak2 LMC 100% Bcr-Abl + PV TE MFI 95-98% Jak2V617F 50% Jak2 V617F 50% Jak2 V617F

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex

Jak2

EPO-R EPO TPO-R TPO = MPL GSCF-R GSCF Mutation V617F :

Exon 12 de Jak2 Domaine pseudokinase JH2 Valine à la place d’une phénylalanine sur le codon 617 Conduit à la

perte du rôle autoinhibiteur

de ce domaine sur le domaine catalytique kinase JH1 =>Une activation constitituve de jak2 => Insensibilité au FC (ex Epo)  Exacerbation de la myélopoïèse via altération mécanismes de

survie/différenciation/prolifération



Thérapeutique ciblée en cours d’évaluation

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex

Jak2

Mutation V617F :

La question comment une même mutation peut elle être à l’origine de phénotypes différents (polyglobulie, thrombocytémie, myélofribrose idiopathique) n’a pas été encore résolue

EPO-R EPO TPO-R TPO = MPL GSCF-R GSCF

ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex

PML-RARA LAM3 :

•Leucémie Aiguë myéloïde •Blocage au niveau du stade promyélocyte •Développement rapide (1 mois) •De bon pronostique si traité à temps : traitement ciblé et efficace par l’acide tout trans rétinoïque (ATRA) et l’arsenic •Association constante avec une anomalie chromosomique :

la t(15;17) ou variante

46,XY,t(15;17)(q22;q21)

46,XY,t(15;17)(q22;q21)

ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex

PML-RARA

• PML =gène supresseur de tumeur

cellulaire) fonction est inconnue Activation de la transcription

• RARa = récepteur de l’acide

rétinoïque (ATRA) facteur de transcription recrute des histone acétyl transferase en présence des concentration physiologique d’ATRA (10-8 M) rôle majeur dans la différenciation myéloïde HAT RARA Inhibition de la transcription par compaction de la chromatine

• PML-RARA = protéine chimère

Exacerbation de la liaison de RAR avec un complexe protéique corépresseur de la transcription (N CoR/Sin3/HDAC1) + physiologique => inefficacité de l’acide rétinoïque à dose répression de la physiologiquement via RARa PML RARA => Blocage Sin3 de HDAC différenciation myéloïde

ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex

bcl2-JH Lymphome folliculaire :

•Forme un groupe homogène du point de vue clinique,morphologique et immunologique •Dérive des cellules B des centres germinatifs normaux •Association dans 70% avec une anomalie chromosomique :

la t(14;18)

ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes :

bcl2-JH Réarrangement bcl2-JH (Lymphome folliculaire)

• Bcl2 :

nature : protéine mambranaire (ancrée aux mambranes/mitochondrie) Rôle physiologique : = inhibitrice de l’apoptose via divers processus : anti-oxydatif/ dans le flux calcique

• JH = partie de jonction de la partie variable du gène de la chaine

lourde des Immunoglobulines mettant à proximité le promoteur du gène

• Bcl2-JH

=> protéine bcl2 qualitativement normale => exacerbation de l’expression de bcl2 via la proximité du promoteur d’IgH => exacerbation de l’activité antiapoptotique de bcl2

=> Inhibition de l’apoptose

ONCOGENESE : Les étapes de la génétique INVERSE : gène-> protéine-> cible thérapeutique Identification sur le caryotype d’un remaniement stéréotypé associé à une hémopathie (banque de données internationales) Techniques de biologie moléculaire (banque génomique ou de cDNA ou FISH (cartographie physique) pour identifier le remaniement.

Analyse des gènes/protéines impliqués non remaniés (fonction physiologique) Analyse du mécanisme d’activation par le remaniement Détermination des cibles des gènes /protéines Analyse de la conséquence du remaniement sur l’homéostasie cellulaire Recherche d’un médicament ciblé sur l’anomalie moléculaire

ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (2)

ex du transcrit bcr-abl

antityrosine kinase : Imatinib/nilotinib spécifique de Abl, PDGF b et a, cKit agit en entrant en compétition avec l’ATP au niveau du site spécifique de liaison à l’ATP présent sur le domaine TK Pour le LMC : a permis d’atteindre une survie à 90% à 5 ans (première ligne)

Site d’action

ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (3) Ex transcrit PML-RARA (LAM3) : ATRA En présence de PML-RARA, l’ATRA à la concentration thérapeutique (10-6 Mol)

-

libère les co-répresseurs et lève la répression de la transcription via RARA Augmente la transcription de RARA HAT RARA Activation de la transcription Inhibition de la transcription par compaction de la chromatine HAT PML RARA => Blocage de différenciation myéloïde

ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (4)

Ex anomalies des voies de signalisation activation mTor (Rapamycine) (LAM) activation NFkb (Velcade) (Myélome )

voies de signalisation

PTEN

mTOR

ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (4)

Ex modifications épigénétiques de l’ADN inhibition des histone desacétylase HDAC (MDS) agent hypométhylant (azacytidine/décitabine) (MDS)

ONCOGENESE : exploration des anomalies de l’ADN MODES d’ EXPLORATION : Translocation +++ Inversion Mutation Délétion Amplification Autres …. Anomalie visualisable à l’échelle du chromosome => Explorée par le caryotype, la FISH et/ou les techniques de biologie moléculaire Anomalie visualisable à l’échelle du gène => exploration par les techniques de biologie moléculaire

Exploration des hémopathies : Caryotype standard Bande G Bande R

der(22)t(9;22) der(9)t(9;22) der(22)t(9;22) der(9)t(9;22)

9q34 22q11

RT-PCR

multiplex

en point final Protocole BIOMED-1 e1a2

e6a2 e19a2 b2a2 b3a2 521 bp 621 bp 586 bp 342 bp 417 bp + Gène de contrôle e1

a3

e6a3 347 bp 447 bp e19a3 412 bp b2a3 b3a3 168 bp 243 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 M

b3a2 b2a2

RT-PCR

quantitative

b2/b3a2 GUILLAUME Jean Protocole standardisé

Ratio bcr-abl/abl 1000 100

117

10 1

2,2 3,6

0,1

1 1 0,4 0,5

seuil de résistance 12 mois seuil de résistance 18 mois 0,01 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Calibrateur Normalisation Bcr-Abl/Abl X100 XFC

Exploration des hémopathies : biologie moléculaire

Analyse des mutations Séquençage PCR RFLP PCR et analyse de fragment

ONCOGENESE : Association anomalie/ diagnostic/pronostic : Anomalie moléculaire/chromosomique primaire /secondaire : ASSOCIATION ANOMALIE DIAGNOSTIC (histologique ou cytologique du type d’hémopathie) ASSOCIATION ANOMALIE PRONOSTIC (survie, sensibilité aux TTT,risque de transformation….) => THERAPEUTIQUE adaptée à la pathologie et adaptée aux risques

LAM : Facteurs pronostiques

Facteurs cytogénétiques

15% 65% 20%

Facteurs cliniques et biologiques

Âge Hyperleucocytose Antécédents de myélodysplasie/myéloprolifératif Facteurs de comorbidités associés Absence de réponse après première cure Expression de gène de résistance aux chimiothérapies

Facteurs moléculaires Pronostic cytogénétique

Favorable (LAM CBF) Intermédiaire Intermédiaire Intermédiaire Intermédiaire

Cible moléculaire C-Kit Flt3-ITD N-Ras CEBPalpha NPM1 Pronostic moléculaire

mauvais mauvais contradictoire bon bon

Allo et FLT3-ITDneg/NPMc Döhner et al, Blood 2005