Transcript ions multichargés - ESBS - Université de Strasbourg

Cours Spectrométrie de Masse
L’ionisation par électropray : l’ESI
Sarah CIANFERANI
Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC)
Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique
Dir : Alain Van Dorsselaer
UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg
Tel: 03 68 85 26 79
[email protected]
Cours ESBS
Oct 2010
Les Sources d’Ionisation les plus utilisées
Ionisation à Impact électronique (IE)
Ionisation Chimique (IC)
Petites molécules volatiles et
thermostables
Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides
(LSIMS ou FAB)
DURES
molécules < 6000 Da
ASSEZ DOUCES
Ionisation par électronébullisation
(électrospray ES ou ESI)
Désorption/Ionisation Laser assistée par
Matrice (MALDI)
Biomolécules (1 300 kDa) et
complexes non-covalents,
protéomique
DOUCES
L’ionisation par électropray : l’ESI
Deux méthodes d’ionisation des biomolécules particulièrement efficaces
et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment
améliorées : le MALDI et l’ESI (ElectroSpray Ionisation).
L’ESI a les caractéristiques suivantes :
- nécessite une introduction de l’échantillon en solution
- génère des ions multichargés (analyse de protéines)
- fonctionne à pression atmosphérique
- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de
vol ou à trappe d’ions.
La source ES : historique
- jusqu’en 1987 : limite de poids moléculaire des composés analysables par MS :
35000 Da dans les cas les plus favorables
- depuis 1988-89 : apparition de la technique d’ionisation par électronébulisation
(electrospray) et possibilité d’analyser des composés de plusieurs centaines a
plusieurs millions de Da)
- 2002 :John. B. FENN : Prix Nobel pour le développement de la technique
d’ionisation pour l’analyse des biomolécules
(1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass
spectrometers
Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B.
Anal. Chem. 57, 675-679 (1985)
2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions
Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, 17021708, (1989)
Principe de l’ionisation Electrospray (ES)
 L’ionisation ES repose sur l’introduction d’une solution aqueuse du composé à
analyser par un capillaire métallique très fin porté à un haut potentiel
 Cette tension crée des charges dans la solution
 A la sortie du capillaire, on a un « nébulisat » (spray) de gouttelettes (1 m)
favorisé par une assistance pneumatique
 L’ionisation par électrospray: ESI
- génère des ions multichargés
- souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou
à trappe d’ions.
Structure d’une source d’ionisation Electrospray (ES)
 Une source d’ionisation par ES est composée :
- d’un capillaire dans lequel est injecté l’échantillon à analyser en solution
- d’un ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la zone à
pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé
 L’ionisation ES est un processus qui a lieu :
- à température ambiante
- à pression atmosphérique (ambiante)
- sous l’action d’un champ électrique
 L’ionisation ES génère des ions multichargés
cap. métal (75 m)
++
+
++
++ +
+
3 à 5 l/min
+ +
+
+ +
TOF
D
V = 3000V
Electrospray:
Formation de gouttelettes chargées
contenant la protéine
Zone de
désolvatation
Zone de
focalisation
des ions
Analyse des produits
en fonction de leur rapport m/z
L’ionisation par électronébulisation (electrospray): ES+
Elle est basée sur un processus électrolytique de : H2O
H+ + OHElle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante
Solution
Cône de Taylor
- + - + - + + - + - +
+- +
+
+
+ - + - +
+ - + +
D
Capillaire
métallique
(appauvri
en
électrons)
++
+
e+
+
SM
Cône
Contre électrode
Générateur de
haute tension
.
Certains OH - sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH
OH
Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à
cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables.
L’ionisation électrospray : principe de la production du spray
Tube capillaire
Débit imposé
par une pompe
0 volt
Champ électrique qui agit
sur le liquide chargé
+ 2000 volts
…………
+ 3000 volts
Effet de pointe qui entraîne
la déformation du liquide
en gouttelettes chargées
Emission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent,
entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés.
Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe.
Electrospray:
Formation de gouttelettes chargées
sous l’effet d’un champ électrique
L’ionisation électrospray : mécanisme de formation des ions
…………
Émission d’un spray visible à la loupe.
Ces gouttelettes sont expulsées,
sèchent, entament des fissions,
et génèrent des ions désolvatés
L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes:
1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution
2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites
3- « transfert » des ions en phase gazeuse
++
++
++
++
Evaporation du solvant
++
++
+
Réduction de taille, mais nombre
de charges électriques constant
(explosions coulombiennes)
L’ionisation électrospray : mécanisme
 Au cours du trajet des ions dans le spectromètre de masse, il y a évaporation du solvant
des gouttelettes.
- diminution de la taille de la gouttelette
- et augmentation parallèle de la densité de charges au sein de la gouttelette
 Il y a un équilibre entre tension de surface de la gouttelette et forces de répulsions
coulombiennes. Plus le solvant s’évapore, plus les forces de répulsion coulombiennes sont
importantes.
lorsque forces de répulsion coulombiennes > tension superficielle
il y a explosion de la gouttelette en une gouttelette plus petite
Au delà d’un certaine limite appelée limite/diamètre de Rayleigh, on observe une fission des
gouttelettes en gouttelettes de plus petites taille.
 Après plusieurs étapes de fissions/explosions, la densité de charge dans la gouttelette
devient telle que le champ électrique local très intense conduit à le désorption des ions
par effet de champ.
 Il se forme alors des ions solvatés constitués de l’ion analyte entouré de molécules de
solvant et de nombreuses charges. L’évaporation des dernières molécules de solvant permet
d’obtenir un ion désolvaté contenant n charges, i.e. nH+ : on parle d’ions multichargés
L’ionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité
Débit de la pompe
…………
Débit du spray
L’électrospray est concentration – dépendant
• Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la
sensibilité.
• L’intensité du courant d’ions produit dépend de la concentration de la solution et
non pas du débit auquel la solution est injectée
• Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible
possible
L’ionisation électrospray : débit élevés et débits faibles
Débit de la pompe
…………
Débit du spray
Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de
solution apporté par la pompe.
• DEBITS ELEVES (1 - 200 microlitres par minute)
En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par
minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la
nébulisation.
• DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute)
Plus l’orifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible.
Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il n’est même plus
nécessaire de pousser avec une pompe; l’aspiration électrostatique suffit à assurer
le débit (nano spray)
L’ionisation électrospray :
pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la
nébulisation (1 à 200 microlitres /min.)
…………
Débit de la pompe
Débit de la pompe
Capillaire d’environ 100 microns
de diamètre intérieur
Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance
pneumatique à la nébulisation.
Flux
d’azote comprimé
…………
Des gouttelettes sont arrachées
à la surface du cône de liquide.
Le système de "canne" d'introduction ESI
Extrémité de canne d'introduction MICROMASS, montrant le capillaire en quartz
qui amène le solution (75 microns de diamètre intérieur).
Le gaz de nébulisation(azote) est améné de façon concentrique par le tube en
métal. La tension de 3 à 4000 volts est appliquée sur le métal.
Le tube de quartz ne doit dépasser que de 0,5mm.
Le système de "canne" d'introduction ESI
L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min.
Débit de la pompe
(Nano LC-MS)
MICRO SPRAY :
capillaire de faible diamètre
(20 à 75 microns)
…………
Débit du spray:
de 0,1 à 1 µL/min
…….…………
NANO-SPRAY :
Débit du spray:
de 1 à 200 nanoL/min
selon Mann et al.
Orifice réduit (1 à 3 microns)
1 - 4 m
D’autres nano-systèmes automatisés permettent des débits de quelques nano-litres par
minutes (Advion,…)
L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min.
Capillaire nanospray vide
E trop faible
E
spray instable
E correct
spray stable
Des puces microfluidiques de nanoES :
ESI Chip™(Advion)
Features
•400 identical microfabricated
nozzles
•Integrated grounded silicon
electrode provides a high,
uniform electric field equivalent
to a 2-mm pulled capillary
Avec une source ESI, l'analyseur peut être:
• Un quadrupôle
Le moins cher et le plus facile
• Une trappe d'ions
MS-MS facile et pas cher
• Un temps de vol
Meilleure résolution qu'un quadrupôle
• Un appareil magnétique
Difficile et cher, mais 20000 de
résolution
• Un FT-ICR
Cher, difficile et lent, mais très haute
résolution
Avantages de l’électrospray
- fonctionne à basse T°C, à pression atmosphérique,
donc peu d ’énergie interne communiquée aux ions
pas de dégradation, les liaisons covalentes ne sont pas rompues
- mesure précise de la masse moléculaire (0.1%) soit ± 1 Da sur M = 10000 Da
- permet d ’extraire des ions de large masse moléculaire (polymère, biomolécule)
- sensible (C  M)
- permet d’extraire des molécules polaires
Inconvénients de l’électrospray
- fournit peu d’information sur la structure, sauf si on effectue de la MS/MS
- très sensible à la présence de sels ou additifs
suppression du signal
dessalage impératif
Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS
Le signal en ES est très sensible à la présence, même à faible concentration, d’agents
contaminants tels que :
- les sels inorganiques (Na, K, etc…)
> 1mM
- les tampons non volatils (Tris, CHAPS, HEPES, phosphates, citrates, etc…)
- les surfactants et les détergents (SDS, Triton, Tween, NP40, etc…)
- les agents chaotropes (urée, sels de guanidine, etc…)
- les solvants non volatils (glycérol, etc…)
> 0.05%
Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS
- Phénomène de compétition à l’ionisation : la présence de ces agents induits une suppression
de l’analyte
I mes A =
kA [A+]
I
kA [A+] + kB [B+]
Courant ionique
produit en source
Courant mesuré
pour A
k : efficacité d’ionisation
- Formation d’adduits pour les contaminants faiblement volatils
- Neutralisation de la charge portée par l’analyte (ex : SDS)
- Modification de la tension de surface de la solution (détergents, glycérol)
Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS
z15978ss 1 (0.067)
477.25
100
TOF MS ES+
60.2
(HEPES)2
Ncp7 (10 M)
dans un tampon HEPES
238 Da
Na+
%
499.23
+ HEPES
Na+
737.36
+ HEPES
475.23
411.44
715.38
500.24
738.36
+ HEPES
Na+
975.45
0
z16040ss 1 (0.067)
TOF MS ES+
213
A5
1027.99
100
Ncp7 (10 M)
dans H2O
%
A4
1284.79
1034.18
A6
856.77
0
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
m/z
L’ionisation par électrospray permet
la mesure de masse de molécules très grosses.
•
Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une
caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions
multichargés.
•
Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas
nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z
élevée.
•
La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la
mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses
monoisotopiques.
Comment déterminer l’état de charge du composé
étudié à partir du spectre de masse ES
On se sert des profils isotopiques
z charges
500.5
100
501.5
%
502.5
m/z
m/z
0
m/z=1
La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da
donc le rapport m/z varie de 1/z
Si z=1
z=2
z=3
m/z=1
m/z=0.5
m/z=0.33 etc
Comment déterminer l’état de charge du composé
étudié à partir du spectre de masse ES
Entre 2 isotopes, m/z = 1
13C
12C
1H
16O
500.5
15N
501.5
14N
18O
37Cl
35Cl
502.5
79Br
81Br
m/z
m/z=1
Si z=1 alors au niveau du profil isotopique
z=2
z=3
m/z=1/1 = 1
m/z=1/2 = 0.5
m/z=1/3 = 0.33 etc …..
Comment déterminer l’état de charge du composé
étudié à partir du spectre de masse ES
500.0
501.0
502.0
m/z
m/z=1
Ici m/z= 1
: on en déduit que ce pic est 1x chargé (monochargé)
On en déduit la masse monoisotopique du composé
M= (500.0x1) – 1 = 499 Da
Comment déterminer l’état de charge du composé
étudié à partir du spectre de masse ES
500.0
500.5
501.0
m/z
m/z=0.5
Ici m/z= 0.5
: on en déduit que ce pic est 2x chargé (dichargé)
On en déduit la masse monoisotopique du composé
M= (500.0x2) – 2 = 998 Da
Spectre ESI d’un peptide de masse monoisotopique 1340,6 Da
avec résolution isotopique sur les ions à une et deux charges
671.32
100
100
Massif isotopique
Dichargé (différence de 0,5 m/z)
671.84
%
1341.65
100
1342.62
%
672.35
Massif isotopique
monochargé
%
0
670
m/z
671
672
673
[M + 2H] 2+
1343.58
[M + H] +
0
1341
1343
1342
1344
m/z
1346
1345
0
m/z
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
2200
2300
2400
2500
2600
2700
2800
2900
La détection du profil isotopique dépend
de la résolution de l’analyseur (Ex de la myoglobine)
17+
On mesure la
masse
monoisotopique
R = 30000
Si
réso
Si
pas de réso
100
R = 2000
On mesure la
masse moyenne
%
0
997
998
999
m/z
1000
Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS:
L'ESI génère des ions multichargés
myo
l1801np 7 (1.028)
A20
848.604
A21
808.225
100
A19
893.205
TOF MS ES+
9.32e3
La masse M et le nombre de
charge z sont
d’abord
calculés à partir de 2 pics.
A18
942.742
A: 16951.47 ± 0.28 Da
A22
771.511
A17
998.161
Ensuite, M est calculée à
partir de chacun des pics de
la série d’ions multichagés.
A23
738.042
%
A16
1060.454
Dans
cet
exemple
on
observe 15 états de charges
différents (10 à 24 charges).
A24
707.297
A15
1131.120
0
500
600
A14
1211.838
999.875
616.164
700
800
900
1000
1100
1200
A13
1304.991
1300
A12
1413.609
1400
A10
1696.147
A11
1542.033
1500
1600
1700
Série d’ions multichargés.
Tous ces pics correspondent à la même
molécule, mais avec un nombre de protons
différents.
m/z
1800
La masse mesurée sera donc
le résultat de la moyenne de
ces 13 mesures, d’où la
grande précision obtenue.
Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS:
Il faut d’abord déterminer les valeurs de z
myo
l1801np 7 (1.028)
A20
848.604
A21
808.225
100
A19
893.205
TOF MS ES+
9.32e3
A18
942.742
A: 16951.47 ± 0.28 Da
Deux pics consécutifs
permettent de
déterminer M et Z1
X1
X2
A22
771.511
A17
998.161
A23
738.042
%
m/z
A16
1060.454
A24
707.297
X1 =
A15
1131.120
616.164
0
500
600
A14
1211.838
999.875
700
800
900
1000
1100
1200
A13
1304.991
1300
A12
1413.609
1400
A10
1696.147
A11
1542.033
1500
1600
1700
M + z1 mH
z1
X2 =
z2 = z1 - 1
m/z
1800
Calcul de Z:
Système de 2 équations
à 2 inconnues
z1 =
X2 - 1
X2 - X1
M + z2 mH
z2
Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS:
Il faut d’abord déterminer les valeurs de z
X1
X2
myo
l1801np 7 (1.028)
A20
848.604
A21
808.225
100
A19
893.205
TOF MS ES+
9.32e3
A18
942.742
A: 16951.47 ± 0.28 Da
A22
771.511
X1 =
A17
998.161
M + z1
M + z2
A23
738.042
%
z1
= 893.205
X2 =
A16
1060.454
z2
= 942.742
A24
707.297
A15
1131.120
0
500
600
A14
1211.838
999.875
616.164
700
800
Calcul de Z:
900
1000
1100
1200
A13
1304.991
1300
z1 =
1400
A10
1696.147
A11
1542.033
A12
1413.609
1500
X2 - 1
X2 - X1
1600
1700
m/z
1800
942.742 - 1
=
942.742 – 893.205
= 19.01
z1 = 19
Calcul de la masse moléculaire de la myoglobine
à partir de la série d’ions multichargés du spectre ESI
m/z
679,12
707,31
737,99
721,5
808,28
848,53
893,24
942,67
998,18
1060,41
1130,95
1211,81
z
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
Moyenne :
Masse
16953,00
16951,44
16950,77
15851,00
16952,88
16950,60
16952,56
16950,06
16952,06
16950,56
16949,25
16951,34
16951,65 +/- 0,17 Da
Une fois que les valeurs de z
sont déterminées (en résolvant le
système
d’équation
à
2
inconnues M et z), la masse
moléculaire de la protéine est
recalculée à partir de chaque pic.
La
moyenne
des
valeurs
trouvées
pour
la
masse
moléculaire est calculée avec
une déviation standard.
Plus il y a d’ions multichargés,
plus la masse pourra être
mesurée avec précision
Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses
monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques
L’ionisation ESI est compatible avec une introduction
directe ou par chromatographie de l’échantillon
Introduction de l ’échantillon:
- direct (infusion)
- couplage LC
Source
Obtention d ’ions
en phase gazeuse
Interface
Focalisation et
transmission des ions
Analyseur
Séparation des ions en
fonction du rapport m/z
Le couplage LC-MS : avec ou sans split
Diviseur
HPLC
SM
rp
Détecteur UV
Collecte des pics
Edman
A2
706.3
100
A: 1410.2 0.4
B: 972.9 0.2
B2
487.6
1.75
100
Trace UV
Spectre
%
6.63
43.13
%
24.73
31.85
37.85
18.43
45.98
58.69
51.16
41.20
63.97
B
A
973.7
707.0
452.0
1410.9
m/z
0
0
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1.75
100
25.85
Chromatogramme
d’ions
33.58
%
46.08
37.85
51.16
30.02
21.38
41.30
54.11
15.89
58.69 62.14
71.40
0
Time
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
Mesure de la masse
moléculaire
de chaque pic élué
1600
1700
Exemples d’instruments ES-MS ou ES-MS/MS
nanoESI-TOF
(Waters)
with Triversa nanomate
(Advion)
ESI-Q-TOF II
(Waters)
ESI-Q-TOF Synapt with IMS (Waters)
ESI-Q-TOF (Bruker)
Applications en ESI-MS
 Vérification de structure et de pureté de molécules naturelles ou synthétiques
 Contrôle du suivi d’une molécule au cours du temps
 Détection et identification de modification
 Couplage LC-MS
 Complexes non covalents
 Informations structurales par MSMS
A retenir à propos de l’ionisation par électrospray (ESI):
1- L’ESI permet de mesurer des masses très élevées par ce qu’elle génére
des ions multichargés (plusieurs millions de Daltons).
2- L’ESI est très douce. On observe que les ions moléculaires qui ne
fragmentent pas.
3- L’ESI permet l’analyse des petites molécules et les massifs isotopiques
permettent de déterminer l’état de charge des différents ions.
4- L’ESI est compatible avec le couplage LC-MS