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DETERMINAZIONE DI POLICLOROBIFENILI IN MATRICI ANIMALI
MEDIANTE ANALISI GC E GC-MS
Menotta* S., Fedrizzi* G., Ferretti** E.
* Laboratorio Chimico Merceologico IZSLE- CCIAA Bologna.
** IZSLE- Brescia
PROCEDIMENTO DI ESTRAZIONE
L'abbinamento dell'analisi GC con la GC-MS permette di individuare e di
confermare la presenza dei policlorobifenili in esame. La sensibilità di un
rivelatore di massa (SCAN) può essere anche 100 volte inferiore rispetto a
quella di un detector a cattura elettronica, ma effettuando l'analisi
monitorando per ogni analita un singolo ione molecolare (SIM) la sensibilità
viene notevolmente elevata e può essere superiore all'ECD.
Tessuto adiposo
(30 g)
RIASSUNTO
In questo lavoro viene proposto un metodo per la determinazione
quali-quantitativa di policlorobifenili (PCB) in prodotti di origine
animale. Il metodo prevede l'estrazione della frazione lipidica dalla
matrice seguita da un’idrolisi e da una doppia purificazione
(Extrelut® e cromatografia ad esclusione molecolare); l'analisi
strumentale condotta sull’estratto finale prevede un abbinamento
GC-ECD e GC-MS. Il limite di rilevazione (LOD) del metodo è di 2
ng/g di grasso e quello di quantificazione (LOQ) è di 3 ng/g di
grasso.
A 100° per una notte
d ev. S td .
C .V .%
R ecu p .%
d ev. S td .
C .V .%
P C B 28
65,38
3,67
5,62
50,54
6,35
12,57
P C B 52
80,54
2,51
3,12
64,16
6,07
9,46
P C B 101
78,99
10,47
13,26
88,00
2,99
P C B 118
94,31
12,43
13,18
117,47
5,12
4,36
P C B 153
91,90
12,59
13,70
99,75
10,23
10,26
P C B 138
89,29
8,50
9,52
103,70
8,07
7,78
P C B 180
90,19
8,30
9,21
100,49
8,08
8,05
o-p- D D E
71,85
10,14
14,11
78,42
10,66
13,60
-Filtrazione su carta
in palloni da 250 mL
Attivazione Extrelut®
Evaporazione solvente
(Rotavapor 55°C)
-Acido Solforico (15 mL)
I policlorobifenili (PCB) sono molecole chimiche di sintesi ottenute
per clorurazione diretta del bifenile. Dalla reazione si possono
ottenere 209 congeneri diversi per grado di clorurazione e per
posizione degli atomi di cloro. Si distinguono per la loro stabilità e
resistenza agli acidi, alle basi, agli ossidanti e ai riducenti. Per le loro
caratteristiche lipofile e le proprietà ignifughe ed isolanti hanno
trovato un larghissimo uso come fluidi industriali, idraulici, ritardanti
delle fiamme e fluidi dielettrici per condensatori e trasformatori.
La loro tossicità si esplica in maniera diversa a seconda del numero
e della posizione degli atomi di cloro presenti. Si manifesta con
lesioni cutanee e oculari e con danni epatici e polmonari. Alcuni
metaboliti presentano attività mutagena e cancerogena.
Il recente problema di contaminazione da diossina e da PCB degli
alimenti provenienti dal Belgio ha riacutizzato il problema della loro
determinazione negli alimenti carnei. La loro determinazione analitica
d’altro canto, risulta essere più semplice dell’analisi delle diossine
richiedendo strumentazioni e procedure meno complesse. In questa
emergenza il problema analitico riguarda principalmente la
determinazione quali-quantitativa dei 7 congeneri (PCB 28, 52, 101,
118, 153, 138, 180) quali indicatori generici di contaminazione.
Data la loro lipofilia, la determinazione dei policlorobifenili viene
effettuata sulla frazione lipidica. L’estrazione del grasso può essere
effettuata con diverse tecniche come l’estrazione solido-liquido, con
solvente apolare mediante estrazione con Soxhlet o con fluidi
supercritici. La purificazione presenta numerosi problemi a causa
degli interferenti presenti ed è possibile procedere con idrolisi acida o
basica della frazione lipidica e successiva estrazione in fase solida
su colonnine Florisil, di silice, C18 o allumina o con una sequenza di
due colonnine. La rilevazione finale è in tutti i casi effettuata in GC
con ECD e in alcuni casi mediante GC-MS.
MATERIALI E METODI
R ecu p .%
d ev. S td .
C .V .%
R ecu p .%
d ev. S td .
P C B 28
44,53
9,82
22,06
0,00
0,00
n.d.
P C B 52
55,26
11,44
20,71
2,93
5,08
173,21
P C B 101
53,91
10,81
20,05
15,74
7,98
50,71
P C B 118
52,18
12,12
23,22
30,11
9,51
31,59
P C B 153
52,27
10,71
20,48
36,32
10,16
27,98
P C B 138
47,17
11,25
23,86
35,77
10,40
29,08
P C B 180
44,06
9,91
22,50
46,10
12,88
27,94
o-p- D D E
41,88
9,97
23,79
11,10
6,47
58,27
-Percolazione
-Eluizione (5 volte con
25 mL di esano)
Concentrazione
e analisi GPC
Eliminazione
del solvente
(Corrente d’azoto)
CONCLUSIONI
Il metodo proposto permette un'analisi della miscela di policlorobifenili
presenti in matrici di origine animale con un limite di quantificazione pari
a 3 ng/g di grasso per ogni PCB analizzato: Il metodo permette una
notevole automazione in quanto la purificazione viene effettuata da un
GPC che a differenza di una SPE non richiede la presenza costante di
un operatore. L'abbinamento fra GC-ECD e GC-MS inoltre permette la
determinazione quali-quantitativa inequivocabile dell'analita presente.
D'altra parte però i tempi di analisi previsti sono piuttosto lunghi e
richiedono quantitativi di solventi piuttosto elevati.
Recupero
campione
GC-ECD
GC-MS
A n a lita
R R F m e d io
D e v . S td .
C .V .%
PC B 28
0 ,7 6
0 ,0 8
1 0 ,7 1
PC B 52
0 ,5 9
0 ,1 0
1 7 ,3 5
PC B 101
0 ,7 7
0 ,0 8
9 ,7 5
PC B 118
0 ,8 4
0 ,0 7
8 ,8 5
PC B 153
0 ,8 6
0 ,0 9
1 0 ,5 0
PC B 138
1 ,0 0
0 ,0 7
6 ,9 8
STRUMENTAZIONE
Stufa, Soxtec System Extraction Unitt, bagno ad ultrasuoni
Apparecchiatura per la cromatografia ad esclusione molecolare
(GPC) (LabService Analitica) con colonna in vetro 50x3 cm ID,
impaccata con una resina SX3 in Stirene-Divinilbenzene 200-400
mesh (LabService Analitica).
Gascromatografo HP 5890 con EPC dotato di iniettore split-splitless
e rivelatore a cattura elettronica (ECD). Colonna HP 5 trace analysis
(30 m, ID 0,25 mm, film 0,25 µm (Hewlett Packard).
Gascromatografo HP 5890 con EPC dotato di iniettore split-splitless
e di rivelatore a spettrometria di massa a quadrupolo tipo 5972A con
colonna HP 5 MS (30 m, ID 0,25 mm, film 0,25 µm).
coeff. di
A nalita
Pendenza (m)
PC B 28
1200
-7676
0,9994
PC B 52
808
30102
0,9993
PC B 101
1181
7979
0,9997
PC B 118
1436
-46499
0,9976
PC B 153
1351
-4603
0,9994
PC B 138
1664
-36408
0,9990
PC B 180
2118
-79431
0,9983
o-p-D D E
1757
-59821
0,9992
2
correlazione (r )
TABELLA 1: Parametri delle rette di calibrazione dei 7
congeneri di PCB analizzati.
1 ,2 1
C .V .%
TABELLA 3: Recuperi degli standard di PCB ottenuti
con 4 diverse metodologie di purificazione
200 µL Toluene
PC B 180
3,40
D ibattim ento co n H 2 S O 4
EX TRELU T
A N A L IT A
Flo r+ A c. S o lf.
A N A L IT A
REAGENTI
Sodio solfato anidro, n-esano, diclorometano e acido solforico 96%,
acetone, etere di petrolio iso-ottano, cicloesano, toluene. Colonne
Extrelut 20 NT, colonnine Florisil (1g). Standard di PCB
(Dr.Erhestonfer) e o-p-DDE (Riedel de Haen) come standard interno.
IUPAC #
Struttura
28
2,4,4’-triclorobifenile
52
2,2’,5,5’-tetraclorobifenile
101 2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenile
118 2,3’,4,4’,5-pentaclorobifenile
153 2,2’,4,4’,5,5’-esaclorobifenile
138 2,2’,3,4,4’,5’-esaclorobifenile
180 2,2’,3,4,4’,5,5’-eptaclorobifenile
Intercetta (q)
Caricamento del
Campione di grasso
(5g in 25 mL di esano)
FL O R IS IL
R ecu p .%
(Ultrasuoni)
PAROLE CHIAVE: Policlorobifenili, GC-ECD, GC-MS, GPC.
INTRODUZIONE
GPC
A N A L IT A
Estrazione
sodio solfato anidro +
150 mL Acetone- Esano
0 ,0 6
E xtrel+ Flo r
E xtr+ G P C
R ecu p .%
d ev. S td .
C .V .%
R ecu p .%
d ev. S td .
C .V .%
R ecu p .%
d ev. S td .
C .V .%
P C B 28
51,08
10,48
20,52
75,16
5,41
7,20
87,82
6,41
7,30
P C B 52
49,39
14,63
29,62
74,46
3,84
5,02
73,46
3,90
5,30
P C B 101
36,69
3,97
10,82
68,59
2,41
3,51
70,50
3,03
4,30
P C B 118
43,08
11,65
27,05
87,61
5,20
5,94
87,85
2,54
2,89
P C B 153
47,91
13,07
27,29
95,64
8,10
8,47
85,38
6,80
7,96
P C B 138
41,91
14,94
35,65
85,55
6,97
8,15
91,84
1,65
1,79
P C B 180
35,01
12,39
35,38
64,90
2,47
3,81
72,39
3,13
4,33
o-p- D D E
38,22
21,80
57,03
76,80
5,50
7,16
74,18
4,45
6,00
4 ,6 9
TABELLA 2: Fattori di risposta dei PCB nei confronti dello
standard interno. (o-p-DDE)
RISULTATI E DISCUSSIONE
TABELLA 4: Recupero % dei 7 congeneri di PCB da matrici fortificate con 10
ng/g di ciascun analita.
I parametri di linearità di risposta in GC-ECD per ogni PCB e del DDE
analizzati sono riportati in Tabella 1. Per ciascun PCB sono stati iniettati 1,
0,75, 0,5, 0,25, 0,1, 0,01 ng. L'elaborazione delle curve è stata effettuata con
il metodo dei minimi quadrati secondo l'equazione y=mx+q. Il limite di
rilevazione del detector a cattura elettronica è di 0,0005 ng di PCB. Per tutti i
PCB considerati è stato calcolato il Fattore di Risposta (RRF) nei confronti
dello standard interno (DDE). In Tabella 2 sono riportati i valori. Nel presente
lavoro sono stati testati 4 diversi singoli passaggi di purificazione: GPC,
colonnina di Florisil, colonna di Extrelut e dibattimento con acido solforico
concentrato. In Tabella 3 sono riportati i recuperi percentuali delle 4
metodologie a confronto; la purificazione con GPC e su colonnina di Florisil
presentano i recuperi e i CV migliori. I recuperi medi della GPC dopo
l'ottimizzazione della miscela di eluizione, erano compresi fra il 65,38% del
PCB 28 e il 94,31% del PCB 118.
Al fine di ottenere dei tracciati cromatografici puliti sono state testate 3
metodologie di purificazione che prevedevano l'abbinamento di 2 diversi
procedimenti di purificazione da adottare in sequenza.
1. purificazione del grasso su Florisil con successivo dibattimento in acido
solforico,
2. idrolisi del grasso su Extrelut e la successiva purificazione su Florisil
3. idrolisi del grasso su Extrelut e la successiva purificazione con GPC
In Tabella 4 sono riportati i recuperi percentuali e i CV per i diversi congeneri.
L'abbinamento dell'idrolisi acida su Etrelut con la cromatografia ad esclusione
molecolare (GPC) determina effettivamente una buona separazione della
frazione contenente i PCB e quindi un estratto pulito. L'idrolisi effettuata prima
della purificazione consente l'utilizzo di quantità di campione di partenza
piuttosto elevate (5g) quindi una maggiore rappresentatività e riproducibilità
delle analisi. Inoltre l'idrolisi acida direttamente su colonna evita in gran parte
la degradazione dei PCB. Questa reazione indesiderata infatti si verifica
frequentemente quando si effettua un'idrolisi acida o alcalina violenta
mediante dibattimento del campione (vedi Tabella 3). Il limite di rilevazione
del metodo è di 2 ng/g di grasso mentre quello di quantificazione è di 3 ng/g
di grasso.
Intervallo di
acquisizione
(m inuti)
13,50-16,00
16,00-20,90
20,90-23,00
23,00-25,50
25,50-30,00
30,00-33,00
PCB
analizzato
Ioni monitorati
28
52
101
118
153/138
180
255,85
291,85
325,85
253,90
359,00
393,70
185,85
219,85
253,85
326,00
289,75
323,75
TABELLA 5: Elenco degli ioni monitorati per ogni
singolo PCB
BIBLIOGRAFIA
1)Safe S., Safe L., Mullin M.: "Polychlorinated Biphenyls:
Congener-Specific Analysis of a Commercial Mixture and a Human
Milk Extract" J. Agric. Food Chem. 1985, 33, 24-29.
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3/6/99.
3) Gazzetta Ufficiale delle comunità europee n° 1999/390/CE del
11/6/99.
4) "Linee guida per interventi analitici mirati al rilevamento di PCB,
PCDD e PCDF in prodotti alimentari" Rif. ISS-XEN-99-4 Versione
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5) Larsen B.R.:"HRGC separation of PCB congeners", J. High
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Shenck F.J., Wagner R., Henness M.K. and Okrasinski L.Jr.:
"Screening of organochlorine Pesticide and Polychlorinated
Biphenyl residues in nonfatty seafood products by tandem solidphase extraction cleanup", J.of AOAC Int. 1994, 77, 102.