Transcript A membrántranszport alapjai

A membrántranszport
molekuláris mechanizmusai
A membrántranszport alapjai 3.
Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát
A membrántranszport alapjai
Membránpotenciál - bevezetés
Általában a sejtek belső tere negatívabb az
extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között.
V
Extracelluláris
+ (0 mV)
Intracelluláris
( -70 mV)
A membrántranszport alapjai
Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség
1. Diffúziós potenciál
Eltérő ionmobilitású anion és kation esetén.
(pl. egy csepp sósav diffúziója)
V
+
Cl-
H+
ΔE
1, az oldat ionjait a koncentráció különbség mozgatja a túloldalra
2, a különböző töltéssel rendelkező ionok átlépési sebessége a szemipermeábilis
hártyán keresztül különböző – az ábrán az előre siető negatív töltésű ionok a
túloldalon negatív töltésű réteget hoznak létre, így átmeneti feszültség: diffúziós
potenciál alakul ki
3, ez lassítja a további anion előrehaladást de gyorsítja a kationok átjutását – ez a
hatás csökkenti a diffúziós potenciált
4, a végén a koncentrációk kiegyenlítődnek, és a diffúziós potenciál eltűnik
Hány darab anion átlépése kell -100 mV
feszültség kialakításához egy 1 μm2-es
membránon?
U 
Q
C
-100 mV
C 1
F
cm
0 ,1 
2
 1  10
 14
F
m
2
96500  x
1  10
 14
 6  10
23
x  6218 db
Persze csak egy pillanatig, amíg a kation párja
azonos irányban őt nem követi
A membrántranszport alapjai
Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség
2. Membránpotenciál
Előfeltétel: egyenlőtlen ionmegoszlás és szelektív permeabilitás
A. Egyensúlyi potenciál
Szelektív permeabilitású membrán
(átmegy: K+, nem: Cl-)
V
-60 mV
100 mM KCl
Cl-
K+
Cl-
K+
Cl-
K+
+
10 mM KCl
1.
K+ áramlás a koncentrációkülönbség miatt
2.
A kialakuló feszültség
leállítja a további áramlást
(egyensúly)
A membrántranszport alapjai
Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség
Az egyensúlyi potenciál jellemzői
-
Néhány ezer ion egyenlőtlen megoszlása elég a
potenciálkülönbség kialakításához, az ionkoncentrációk
változása elhanyagolható.
-
Az egyensúlyi potenciál tartósan (elvileg végtelen ideig)
fennállhat. Ilyenkor a koncentrációkülönbség miatt az
egyik irányba ugyanannyi ion mozog, mint a
potenciálkülönbség miatt a másikba.
-
Minél nagyobb a membránon átjutó ion két oldalon
található koncentrációinak hányadosa, annál nagyobb a
potenciálkülönbség.
Az egyensúlyi potenciál kiszámítása
- Nernst egyenlet:
E=
- RT
zF
cBELSŐ
ln c
KÜLSŐ
E : membránpotenciál (volt)
R: általános gázállandó ( 8.31 J/mol/K)
T: abszolút hőmérséklet (K)
z : töltésszám (K+-ra: pl. +1)
F : Faraday-állandó ( 96500 C/mol)
-
Gyakorlatban jól használható formája:
- 60 mV
E=
z
cBELSŐ
log10 c
KÜLSŐ
Az egyes ionok egyensúlyi potenciálja állati sejtekben
fiziológiás ionmegoszlások esetén
- 60 mV
EK=
+1
- 60 mV
ENa=
+1
ECl=
140 mM
log10
4 mM
log10
 - 90 mV
15 mM
 + 60 mV
140 mM
4 mM
- 60 mV
log10
 - 80 mV
103 mM
-1
- 60 mV
ECa=
+2
log10
10-7 M
10-3 M
 + 120 mV
A membrántranszport alapjai
Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség
B, Donnan-potenciál
-
Ionokra átjárható, fehérjére nem permeábilis membrán esetén jön létre
-
A negatív töltésekkel rendelkező fehérjék oldalán nagyobb kation koncentráció és a
kis molekulájú, permeábilis anion alacsonyabb koncentrációja alakul ki az ellenkező
oldalhoz képest, egyensúlyi állapot formájában. -10 – -15 mV potenciálkülönbség
jön létre. (A fehérjék oldala a negatívabb.)
-
A sejt nyugalmi membránpotenciálja döntően NEM a Donnan-potenciálon alapul.
A membrántranszport alapjai
Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség
C. Pumpapotenciál
-
A H+-pumpa, és állati sejtek esetén a nátrium pumpa (Na+/K+-ATPáz)
elektrogén. (3 Na+ ki, 2 K+ be)
-
A H+-pumpa (és Na+-pumpa) folyamatos működése ezért negatívabbá
teszi a sejt belsejét. Ez közvetlenül csak kb. 10-20 mV-tal járul hozzá a
membrán-potenciálhoz.
-
A Na+-pumpa azonban az egyenlőtlen külső és belső Na+ és K+
koncentrációkat biztosítja, és így közvetve a membránpotenciál
fenntartásához szükséges.
A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet I.
PK>>PNa=0
V
PCl=0
“I”
-60 mV
Cl-
K+
Cl-
K+
Cl-
K+
“E”
Em = ?
K+ egyensúlyi
potenciál !!
+
10 mM NaCl
100 mM NaCl
100 mM KCl
10 mM KCl
Vm = -60 mV
IK=INa=0
A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet
II.
PNa>>PK=0
V
+60 mV
“I”
+
Na+
Cl-
Na+
Cl-
Na+
Cl-
PCl=0
“E”
10 mM NaCl
100 mM NaCl
100 mM KCl
10 mM KCl
Em = ?
Na+ egyensúlyi
potenciál !!
Vm = +60 mV
IK=INa=0
A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet III.
PNa=PK>0
V
PCl=0
0 mV
“I”
“E”
Em = ?
Na+
IK = -INa>0
Vm = 0 mV
K+
10 mM NaCl
100 mM NaCl
100 mM KCl
10 mM KCl
Koncentrációkiegyenlítődés
A III. gondolatkísérlet ‘tanulságai’
1. A kifelé áramló pozitív töltések áramát tekintjük pozitívnak
hagyomány szerint. (A példában IK>0)
2. Stabil membránpotenciál esetén a membránon átfolyó összes
áram összege nulla. (A példában IK+INa=0) (Egyébként
valamelyik oldalon töltésfelhalmozódás lenne, és Vm változna)
3. Ha membrán többféle ionra is permeábilis, akkor hosszú idő
után a koncentrációk kiegyenlítődhetnek.
(A példában mindkét oldalon [Na+] = [K+] = 55 mM értéken).
In vivo ezt a Na+-pumpa akadályozza meg.
IV. Az állati sejtek nyugalmi membránpotenciálja
PK >>PNa>0
V
PCl=0
“I”
“E”
+
Na+
K+
10 mM NaCl
100 mM NaCl
100 mM KCl
10 mM KCl
IK = -INa>0, mert egyensúly van
Vm hol van az
(állandó
EK, 0,VEmNa)
értékekhez
EK < Vm << 0
képest?
Koncentrációkiegyenlítődés
A IV. gondolatkísérlet ‘tanulságai’
Egy ‘átlagos’ nyugvó állati sejtben:
- kifelé K+ áramot befolyásolja:
 nagy koncentrációkülönbség
 nagy K+ permeabilitás
 negatív membránpotenciál
- befelé Na+ áramot befolyásolja:
 nagy koncentrációkülönbség
 kis Na+ permeabilitás
 negatív membránpotenciál
Így a két áram egyenlő  stabil nyugalmi Vm
A membrántranszport alapjai
A membránpotenciál kiszámítása
• Vm: EK és ENa között van.
Hogy hol, az a PK és PNa arányától függ.
• PNa<PK (nyugalmi) esetben: EK<Vm<<ENa
• PNa>PK esetben: EK<<Vm<ENa
gK
gNa
• Képlettel: Vm= g
EK+ g
ENa+…
teljes
teljes
(ahol g=1/R: vezetőképesség (Siemens))
• Vm kiszámítható (Goldman-Hodgkin-Katz, GHK)
Vm =
- RT
zF
ln
PK[K+]I+PNa[Na+]I+PCl[Cl-]E
PK[K+]E+PNa[Na+]E+PCl[Cl-]C
Mitől és milyen irányban változhat a
membránpotenciál?
Vm  : depolarizáció
“pozitívabbá válik”
Vm  : hiperpolarizáció
“negatívabbá válik”
1. Ionkoncentráció változás (in vivo nem jellemző)
pl.
(V – E
+
I

[K ]E  IK, out  depol.
R
[Na+]I   INa, in   hiperpol.
m
x
2. Permeabilitás változás (in vivo a szab. fő útja)
pl.
PK  IK  hiperpol.
PNa  INa  depol.
x
)
 g  (V m – E x )
A membrántranszport alapjai
Szelektív permeabilitás - ioncsatornák
Mi biztosítja a sejtmembrán szelektív
permeabilitását?  Ioncsatornák
•
Transzmembrán fehérjék, melyek hidrofil pórust képeznek ionok számára
•
•
•
Egy ion transzportja során nincs konformációváltozás, csak nyitás  zárásnál
Igen magas katalitikus szám (106-108 ion/sec)
Erősen szelektívek lehetnek (1 hiba/103-104 ion)
•
Nyitás  zárás szabályozott lehet, ez alapján csoportosíthatók:
- ligandfüggő
- háttér (csurgó, leak)
- feszültségfüggő
- mechanoszenzitív
A membrántranszport alapjai
Szelektív permeabilitás - ioncsatornák
Ionszelektivitás szerinti felosztás
kationcsatornák
Szelektív
(K+, Ca2+)
anioncsatornák
(Cl-, NO3-)
nem
specifikus
csak egyértékű
(monovalens) ionokat
ereszt át (Na+ és K+)
kétértékű (bivalens)
ionokat is átereszt
(Na+, K+ és Ca2+)
A membrántranszport alapjai
Kation csatornák pórus hurkokkal
Egy pórus hurkokkal rendelkező K+ioncsatorna háromdimenziós modellje
oldal- és felülnézetben.
A különféle ioncsatorna-féleségek alegységeinek síkban kiterített szerkezete.
Pórus motívum
K+ csatorna
alegységek
A csatorna négy alegységből szerelődik
össze.
+
M
1
M
2
S S
1 2
N
S S
3 4
+
S
5
S
6
N
C
C
C O2
+H N
3
O u t s id e
+
S S
1 2
S S S
3 4 5
+
+
S
6
S
1
S S
2 3
S S
4 5
+
+
S
6
S S
1 2
S S
3 4
+
+
S
5
S
6
S S
1 2
S S S
3 4 5
+
S
6
In s i d e
C O2
+H N
3
Amíg egyes K+-csatornák két, vagy négy
alegységből szerelődnek össze, addig a
Na+- és Ca2+-csatornákat egyetlen
hosszú polipeptid lánc alkotja.
M
1
M
2
N
C
+
S S
1 2
S S
3 4
+
N
S
5
S
6
C
K+ csatornák
K+ csatornák
Nátrium & Kalcium
+
S S
1 2
S S
3 4
+
S
5
S
6
M
1
O u t s id e
+
N
S S
1 2
C
S S S
3 4 5
+
+
S
6
S
1
S S
2 3
S S
4 5
+
+
S
6
S S
1 2
S S
3 4
+
M
2
+
S
5
S
6
S S
1 2
S S S
3 4 5
+
S
6
N
In s i d e
C
C O2
+H N
3
Feszültségkapuzott
KQT
eag
slo
CNG
Novel
+H N
3
C O2
> 23 gén
Kir 1 Kir 2 Kir 3 Kir 4 Kir 5 Kir 6 Kir 7 n IRK
KVLQT KVLQT2
slo slo2/slack
Kv 1
Kv 2
Kv 3
Kir 3 .1
Kv 4
Kir 3 .2
Kir 3 .3
Kir 3 .4
eag erg elk
Kv 1 .1 , Kv 1 .2 , Kv 1 .3 , Kv 1 .4 , Kv 1 .5 , Kv 1 .6 , Kv 1 .7 , Kv 1 .8
A Ca2+- és a Na+-csatornák génjei egy ősi K+-csatornagén ismételt duplikációja és módosulása nyomán
képződtek.
Az ioncsatornák génjei az evolúció során kialakult és
bevált funkció megőrződéséről, variálódásáról szólnak.
Szűk nyaki rész: 1,2 nm hosszú, átmérője 0,28 nm.
A csatorna átmérője szabja meg, hogy milyen ionok
haladhatnak át rajta. A nyaki rész falát a pórusmotívum
(signature sequence) aminosavjai burkolják. Mivel a K+-ionok
hidrátburkát alkotó vízmolekulák 0,28 nm-re vannak a K+-ion
középpontjától, a járat túl szűk egy K+-ion áthaladásához.
A hidrátburok vízmolekuláit csak komoly energiabefektetés
árán lehet eltávolítani, ám a K+-csatornák működésük során
nem fogyasztanak energiát.
Mégis, miként lehetséges az, hogy a nyitott K+-csatornán
másodpercenként nagyjából egymillió K+-ion halad át?
A szűk járat belső felszínén karbonil- (C=O) oxigénatomok vannak. Az oxigénatomok részleges negatív
töltést hordoznak, és úgy helyezkednek el, hogy a
járaton áthaladó K+-ionok a hidrátburok vízmolekulái
helyett az oxigénatomokkal lépjenek kölcsönhatásba.
A kölcsönhatás energetikailag kedvező környezetet
teremt az ionok áthaladásához.
A szelektivitási filter szerkezete: a VGYG motívum
KcsA (2TM1P) csatornában
A szelektivitási filter szerkezete
(karbonil oxigének)
Roderick MacKinnon (47), laureate
of the Nobel Prize in Chemistry 2003
K+ ionok (zöld) és víz molekulák (piros)
áthaladása a póruson. „Billiárd-típusú”
átjutás
A membrántranszport alapjai
Kálium ionok átjutása Kv1.2 csatornán – számítógépes szimuláció
A membrántranszport alapjai
A szelektivitási filter szerkezete (a K+ szelektivitás mechanizmusa)
A K+-nál (1,33 Å) kisebb átmérőjű Na+-ionok (0,95 Å) számára a karboniloxigén-atomok (C=O)
túlságosan távol helyezkednek el, amiért nem tudnak az ionnal kölcsönhatásba lépni, ami
miatt a Na+-ionok nem tudnak átjutni a K+-csatornákon.
Másképpen: a Na+-ionok erősebben kötik a vizet, mint a K+-ionok, nem képesek elegendően közel
menni a szűrőhöz, hogy elveszítsék a hidrátburkot. Szelektivitás: 1:1000.
K+
Na+
Kapuzás a “belső szájadékban”
A kapuzó hélix (H5) helyzetét a
sejtmembránban az határozza
meg, hogy milyen kölcsönhatás
van a membrán két oldalán
felhalmozódott töltések és a
kapuzó hélixek töltése között.
Depolarizáció során a kapuzó hélix a sejthártya külseje felé mozdul, és miközben megváltozik
az ioncsatorna szerkezete, kinyílik, rajta ionok áramlanak át.
Állati sejtekben az átáramló ionáram erőssége már a depolarizáció alatt csökkenni kezd, mert a
csatorna inaktiválódik.
A membrántranszport alapjai
Az inaktiváció
Állati sejtekben a feszültségfüggő Na+ csatorna inaktiválódik (akciós potenciál).
Növényeknél nem jellemző a hasonló inaktiváció (pl. GORK 30 percig is aktív
marad), az AP másként keletkezik.
A csatornának 3 funkcionális állapota van:
Zárt
Depolarizáció
Inaktív
(nem vezet)
Nyitott
Az inaktiváció kísérletes kimutatása
(makroszkópos áram)
zárt
nyitott
inaktív
Em
INa
Idő (ms)
A megnyílás és az inaktiváció is statisztikus
jelenség az elemi áram szintjén
Em
elemi áramok
több mérés során
egy csatornán
összegzett
áram
Idő (ms)
Inaktiváció “tömeszeléses” mechanizmussal: N-típusú inaktiváció
Az N típusú inaktiváció esetében az ioncsatorna fehérje N-terminálisa a
pórus citoplazma felőli bejáratához kötődik, bedugaszolja a csatornát
Kapuzás a szelektivitási filterben: C-típusú inaktiváció
C típusú inaktivációt - nevével ellentétben - nem a fehérje C-terminálisa,
hanem a szűk nyaki rész körüli fehérjerészek okozzák: az ioncsatorna a
fényképezőgépek blendéjéhez hasonlatos módon záródik.
A szelektivitási szűrő K+-függő
szerkezetváltozásának biológiai jelentősége.
szelektivitási szűrő
2
1
aktivációs kapu
A szűrő kálium-koncentrációtól függően zárt (low K+) és nyitott (high K+) állapotú lehet.
Ha az aktivációs kapu nyílik (1), több kálium jut a szűrő közelébe, high K+ állapotú szűrő
 nyitódás (2). Zárt aktivációs kapu esetén a low K+ állapot alakul ki.
Ez a magyarázata a milliszekundumos nagyságrendű „pislákoló” ioncsatorna
nyitódásnak-záródásnak, mely még nyitott feszültség-függő aktivációs kapu esetén is
mérhető.
A membrántranszport alapjai
K-csatorna inaktiváció
Nyugalmi helyzet,
zárt csatorna
Depolarizált sejthártya,
nyitott helyzet
Depolarizált sejthártya,
N-típusú inaktiváció
Depolarizált sejthártya,
C-típusú inaktiváció
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp
Sejtre tapasztott (cell-attached) felállás
Feszültség clamp
mért csatornák
Mekkora áramot
kell átfolyatnom,
hogy Vm az általam
megkívánt érték
legyen?
Pipetta széle és a
membrán között
NAGY (G) ellenállású
kapcsolat (seal).
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp
Teljes sejt (whole cell) felállás
Feszültség clamp
mért csatornák
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp
Kivágott folt (excised patch) felállás
Feszültség clamp
mért csatorna/csatornák
(Akár egy csatorna
árama is mérhető, az áram
pA (10-12 A) nagyságrendű.)
Nyitott
Zárt
Az ioncsatornák működése: makroszkópos áram
(sok ugyanolyan csatorna együttes árama)
K+ szelektív pórus (PK konstans, nem függvénye Vm-nek),
szimmetrikus oldatok
Feszültség-áram
összefüggés
C1 < C2
I
C2
C1
Vm (mV)
Pl.:
mindkét oldalon 4 mM [K+]
mindkét oldalon 140 mM [K+]
K+ szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok
I
EK
C2
C1
Vm (mV)
Pl.:
belül C2=140, kívül C1=4 mM [K+]
IK=0, ha Vm=EK
Feszültségfüggő, kifelé rektifikáló K+ csatorna (pl. GORK)
PO
Vm (mV)
nyitási
valószínűség
I
leak (csurgó)
K+ áram
(EK fölött IK>0)
EK
Vm (mV)
I
Feszültségfüggő csatorna
K+ árama
(EK és küszöb között IK=0)
EK
Vm (mV)
küszöb  -30 mV
Befelé rektifikáló K+ csatorna (pl. KAT1)
PO
Vm (mV)
nyitási
valószínűség
I
leak (csurgó) K+ áram
EK
Vm (mV)
EK
I (nagyítva!)
Vm (mV)
bef. rekt. csatorna K+
árama
(EK felett: IK>0
csak egy szűk
tartományban)
Cl- szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok
I
C1
C2
Vm (mV)
ECl
Pl.:
belül C1=140, kívül C2=15 mM [Cl-]
ICl=0, ha Vm=ECl
Feszültségfüggő Cl--csatorna
Vm (mV)
nyitási
valószínűség
I
leak (csurgó)
Cl- áram
Vm (mV)
ECl
I
küszöb
 -75 mV
Vm (mV)
Feszütségfüggő
csatorna Cl- árama
ECl
ECl pozitív értékű, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell
A membrántranszport alapjai
6. A növényi ioncsatornák működése
PM, Anion csatornák
Turgor beállításnál hipotóniás stressz esetén a sók kiáramlását szabályozza Szerkezetük: 13 TM szegmens
Legfőképp Cl- ionról van szó, ezek Ca2+-aktivált csatornák, 2 osztálya van:
S(slow)-típusú és R(rapid)-típusú feszültségfüggő anion csatorna
R-típusú
S-típusú
ECl általában pozitív értéket ér el, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell
3 db fontos funkció:
A csatornák nyitódása nem csak Cl- vesztést eredményez, hanem membrán depolarizációt is okoz.
Ez aktiválja a kifelé egyenirányító K+-csatornákat a sók kiáramlásánál.
A jelátvitel során tapasztalható membrán-depolarizációban központi jelentőségű.
Erős hiperpolarizáció esetén nyitódnak (ha a befelé egyenirányító K+-csatornák működése gátolt pl. kevés
külső K+ cc. esetén)