Transcript Materiały.

Zastosowanie kalorymetrii ITC
w badaniach białek
Katarzyna Breer
Kalorymetria,
czyli ,,mierzenie ciepła’’
• DSC (differential
scanning calorimetry)
• ITC (isothermal titration calorimetry)
www.microcal.com
T – const, p – const
Leavitt and Freire 2001
81 mM domena SH2 Lck
ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA
Current Opinion in Structural Biology
Warianty metody
• Enzym/substrat/inhibitor
• Single injection
• Dysocjacja (dimeru)
Kalorymetr ITC
VP-ITC
• Objętość celki ~1.4 ml
• Objętość strzykawki ~ 270ml
• Peltier 2-800C
• Szum 0.5 ncal/s
Jakie informacje można uzyskać z krzywej
miareczkowania ITC?
T im e (m in )
0
20
40
60
80 100 120 140
Miareczkowanie ~8 mM PNP (cielęce)
Guaniną
µ ca l/se c
0 ,0
-0 ,2
20 mM Hepes pH 7.0, 250C
kca l/m o le o f in je cta n t
-0 ,4
-0 ,6
0
DQL=DHL
-3
-6
-9
DQML=DHML
-1 2
-1 5
-1 8
0 ,0
0 ,5
1 ,0
M o la r R a tio
1 ,5
DHcal
Identyczne, nieoddziałujące
miejsca wiązania
 – frakcja miejsc zajętych
Ka 

(1 -  )[ L ]
1-  – frakcja miejsc wolnych
[L]t  [L] + n[M]t
Q  n[M]t ·V0DHML
D Q ( i )  Q ( i ) - Q ( i - 1) 
dV i  Q ( i )  Q ( i - 1) 

V 0 
2

Parametr sigmoidalności
2
0
10 < C < 1000
Ka ~108 – 109 M-1
here
-2
D H (k c a l/m o le o f in je c ta n t)
C = Ka [M]t
M a xim u m C o n c. : 3 m M
M in im u m C o n c. : 0 .0 1 m M
O p tim a l C o n c. : 0 .1 m M
S im u la te d C o n c. : 0 .0 3 m M
-4
-6
-8
K a= 1 m M
-1 0
-1
D H = -1 5 kca l/m o l
-1 2
N=1
-1 4
-1 6
Wiseman et al. 1989
0 ,0
0 ,5
1 ,0
M o la r R a tio
1 ,5
2 ,0
Proteaza HIV-1
KA
~KB
K app 
Leavitt and Freire 2001
KB
(1  K A )[ A ]
Wiązanie kompetycyjne
DH
A
DH B
A  M  MA
B  M  MB
Słaby inhibitor
Silny inhibitor
KA 
A
(1 -  A -  B )[ A ]
KB 
B
(1 -  B -  A )[ B ]
DQ(i) = V0 [M]t (DHADA(i) + DHBDB(i))
Sigurskjold 2000
Parametry termodynamiczne
U(S,V,N) = TS – pV + SmN
dU (S,V,N) = TdS – pdV + SmidNi
Naturalne zmienne ITC to (T,p,N)
G (T,p,N) = U – TS + pV = SmiNi
dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + SmidNi
dG  0
Energia chemiczna
Proces spontaniczny
Związek entalpii, entropii
i energii swobodnej Gibbsa
G = U + pV – TS = H – TS
dG = dH – TdS
Wkład entalpowy (cieplny)
• Wiązania wodorowe
• Oddziaływania van der
Waalsa
• Oddziaływania
elektrostatyczne
Wkład entropowy
• Solwatacja
• Wewnętrzne stopnie swobody
DG = -RTln Ka
D H kcal/m ole of injectant
1,8
1,6
~0.2 mM PNP
F /F 0
1,4
1,2
1,0
0,01
0,1
0
1
c G ua [uM ]
~8 mM PNP
-2
-4
-6
-8
-1 0
-1 2
-1 4
0 ,0
0 ,3
0 ,6
0 ,9
M o la r R a tio
N = 0.5  0.1
N = 0.6
Ka = (11.3  0.9) 106 M-1
Ka = (4.9  0.4) 106 M-1
250C,
20 mM Hepes pH 7.0
1 ,2
DHcal = -14.2  0.1 kcal/mol
TDS = -5.0 kcal/mol
T im e (m in )
0
30
60
90
120
150
180
0 ,8
0 ,0
-0 ,4
-0 ,8
6
300
4
250
F luorescence [A .U ]
D H kca l/m o le o f in je cta n t
µ ca l/se c
0 ,4
2
0
-2
-4
-6
200
150
100
-8
0 ,0
0 ,5
1 ,0
M o la r R a tio
1 ,5
[M]t = 0.92 mM
50
0 ,0
[M]akt = 0.96 mM
Ka = (5.3  2.5) 109 M-1
0 ,3
0 ,6
0 ,9
1 ,2
1 ,5
D F P P -D G [ m M ]
1 ,8
2 ,1
Zachowania nieszablonowe
• Niezależnie wiążące
miejsca
K1 
1
(1 -  1 )[ L ]
K2 
2
(1 -  2 )[ L ]
• Miejsca oddziałujące –
kooperacja
K1 
1
(1 -  1 -  2 )[ L ]
[L]t  [L] + [M]t(n11DH1+n22DH2)
Q  [M]tV0(n11DH1 + n22DH2)
K2 
2
 1[ L ]
K o o p eratyw n e w iązan ie
6
3
D H k ca l/m o l o f in je cta n t
0
-3
-6
0
1
2
3
4
M iejsca w iążące n iezależn ie
6
3
0
-3
-6
0 ,0 0
0 ,2 5
0 ,5 0
0 ,7 5
M o la r R a tio
1 ,0 0
1 ,2 5
1 ,5 0
Miareczkowania PNP ligandem
DFPP-DG
N1 = 0.8
K1 = (6.7  6.4 ) 1010 M-1
DH1 = -6.3  0.05 kcal/mol
TDS1 = 8.2 kcal/mol
N2 = 0.2
K2 = (3.1  2.8) 108 M-1
DH2 = 5.8  0.2 kcal/mol
TDS2 = 17.6 kcal/mol
N = 1.0
Ka = (1.2  0.5) 109 M-1
DH = -5.7  0.04 kcal/mol
TDS = 6.6 kcal/mol
D H k c a l/m o l o f in je c ta n t
6
~ 4 0 m M P N P 2 9 -3 0 U /m g
~ 2 0 m M P N P ~ 3 4 -3 5 U /m g
~ 2 0 m M P N P ~ 2 9 U /m g
4
2
0
-2
-4
-6
0 ,0 0
0 ,2 5
0 ,5 0
0 ,7 5
1 ,0 0
1 ,2 5
M o la r R a tio
20 mM Hepes pH 7.0, 200C
1 ,5 0
Analiza van’t Hoff’a
Ka
D G (T )  - RT ln K a (T )  D H
ln K a (T )  -
Izobara van’t
Hoff’a
 ln K
T
DH
R

0
0
- TDS
0
0

DS 
1

   

T
R
  

DH
0
Entalpia
RT
2
van’t Hoff’a
Ka
 D H (T )
0
DC p 
Entalpia
van’t Hoff’a
T
D H (T )  D H (T H )  D C p (T - T H )
0
D S (T )  D S (T S )  D C p
0
 T
ln 
 TS




Polimeraza Klenowa
Forma całkowa
izobary van’t Hoff’a
Datta et al., 2006
DC p 
 T 
TH
ln K a (T )   ln   
1 R 
T
 Ts  
Napędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS
DCp ~ - (0.9 – 1.2)
kcal/(mol K)
Zależność DHcal(T)
dla wiązania DFPP-DG przez PNP
DH
k c a l/m o l o f in je c ta n t
-3
• DCp – const.
• DCp = -0.202  0.031
kcal/(mol K)
-4
-5
-6
-7
-8
280
285
290
295
T em perature [K ]
300
Zależność Kas (T)
34
• Kas ~109-1011 M-1
• Poza zakresem pracy
metody
32
30
ln K a s
28
26
24
22
20
18
16
3,32
3,36
3,40
3,44
3,48
1/T [1000/K ]
3,52
3,56
N = 0.9
N1 = 1.0
N2 = 0.1
Ka = (1.4  0.1) 107 M-1
K1 = (0.2  1.7) 1011 M-1
K2 = (0.4  3.0) 109 M-1
DH = -12.0  0.1 kcal/mol
DH1 = -6.2  0.1 kcal/mol DH2 = 9.6  2.6 kcal/mol
TDS = -2.4 kcal/mol
TDS1 = 7.6 kcal/mol
2
4
 ligand Guanina
D H kca l/m o l o f in je cta n t
DH kcal/m ole of injectant
0
TDS2 = 1.7 kcal/mol
-2
-4
-6
-8
-1 0
-1 2
-1 4
0 ,0
0 ,5
1 ,0
M o la r R a tio
1 ,5
2
ligand D F P P -D G
0
-2
-4
-6
0 ,0 0
0 ,2 5
0 ,5 0
0 ,7 5
1 ,0 0
M o la r R a tio
1 ,2 5
1 ,5 0
Zmiany entropii i entalpii
DH (T) = DHconf (T) + DHintrinsic (T)
DS (T)= DSsolv (T) + DSconf (T) + DSinne(T)
DSsolv (T) = DCpln(T/TS)
ASA
solvent accessible surface area
DH = DHconf + a(T)·DASAap + b(T) ·DASApol
Luić et al. 2004
DCp ap < 0
DCp pol > 0
Kompleksy białko – białko
Fab E8 cytochrom c
oraz przeciwciało E8
DCp ~ - (0.2 – 0.6)
kcal/(mol K)
Mylvaganam et al., 1998
DHcal – DHvH = const
Przepływ protonów
DHapp = DHbind + nH+DHion
Miareczkowania proteazy
HIV-1 indivinavirem
• Acetate 0.1 kcal/mol
• MES 3.7 kcal/mol
• ACES 7.5 kcal/mol
Todd et al., 2000
Równowaga dynamiczna
Kconf
jedna forma wiąże
obie formy wiążą ligand
K1
DCp app
K0
Eftink et al., 1983
log Kconf
Kompleksy białko – DNA
Temperature
Dragan et al., 2004
Jak projektować inhibitory?
5·1010 M-1
4·109 M-1
9·1010 M-1
1011 M-1
DG
4
DH
-T D S
2
kca
l/ml/m
ol ol
kca
0
-2
-4
-4
-6
-6
-8
-8
-1 0
0
-1
-1 2
2
-1
-1 4
4
-1
viirr
v iirr
a
a
v
v
n
ina
raa n a
p
II nnddi n
i
r
TT i p
130x
15x
vv iirr
6 44
a
7
6
n
N II- 7
rr uu n a
a
K
N
Da
K
D
25x
Muzammil et al., 2007
40x
Mutant V82F/I84V
DG
DH
-T D S
9
6
3
k c a l/m o l
0
-3
-6
-9
-1 2
-1 5
-1 8
In d
v
in a
700x
ir
pr
Ti
a
v
na
50x
ir
KN
20x
I-7
64
Da
ru
20x
v
na
ir
MDR mutant
Allosteria
,,entropowa”
Białko CAP
Na podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC
BRAK ZMIAN
KONFORMACYJNYCH
ms – ms powolne ruchy domen
Podziękowania dla:
Romana Szczepanowskiego
Matthias’a Bochtler’a
Energie wiązań:
Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol
Wodorowe
Hydrofobowe
van der Waalsa
4-25 kJ/mol
4 kJ/mol
0. 5 kJ/mol
• DS > 0 woda została wypchnięta z
powierzchni kompleksu
• DS < 0 może mieć wiele przyczyn i nie
koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła,
bądź się nie zmieniła